丁酸通过激活G蛋白偶联受体41_43通路降低高血压大鼠血压.pdf
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1、Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9丁酸通过激活G蛋白偶联受体41/43通路降低高血压大鼠血压秦春迪,马雯,李圆,朱雅泉,李瑜,邹琳,张昕摘要:目的探讨丁酸通过激活G蛋白偶联受体41/43(GPR41/43)通路降低高血压模型大鼠血压的机制。方法75只雄性SD大鼠随机分为假手术组(15只)和造模组(60只),采用两肾一夹方法建立高血压大鼠模型,将成模鼠随机分为对照组(超纯水0.1 mL/kg)、丁酸高剂量组(220 mg/kg)、丁酸低剂量组(110 mg/kg)和缬沙坦组(30 mg/kg),每组15只,连续灌胃给药4周。分别在给药前后测量大鼠尾动
2、脉收缩压(SBP)及心率(HR)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠胸主动脉组织中IL-6、TNF-、eNOS的mRNA表达水平。免疫组织化学染色检测大鼠胸主动脉GPR41/43表达量。结果给药2周,对照组大鼠SBP较假手术组显著升高(P0.05),丁酸高剂量组、丁酸低剂量组、缬沙坦组SBP较对照组降低,且丁酸高剂量组低于低剂量组(P0.05)。给药4周,丁酸高剂量组较丁酸低剂量组SBP明显降低(P0.05);给药前后各组大鼠HR差异均无统计学意义(P0.
3、05)。给药后丁酸高剂量组、丁酸低剂量组eNOS蛋白和mRNA表达量较对照组增加,IL-6、TNF-蛋白及mRNA表达量均降低(P0.05)。免疫组织化学染色显示,大鼠胸主动脉组织的GPR41/43表达较对照组增加,且高于缬沙坦组(P0.05)。结论丁酸对高血压大鼠有明显的降压作用,可能与激活GPR41/43通路增加血管舒张,抑制炎性因子表达有关。关键词:丁酸盐类;高血压;受体,G-蛋白偶联;白细胞介素6;肿瘤坏死因子;一氧化氮合酶型中图分类号:R349.6文献标志码:ADOI:10.11958/20221713Butyrate reduces blood pressure in hypert
4、ensive rats by activating the G protein-coupledreceptor 41/43 pathwayQIN Chundi,MA Wen,LI Yuan,ZHU Yaquan,LI Yu,ZOU Lin,ZHANG XinDepartment of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University ofScience and Technology,Baotou 014010,ChinaCorresponding Author
5、E-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism of butyrate reducing blood pressure in hypertensive model rats byactivating G protein-coupled receptor 41/43(GPR41/43)pathway.MethodsSeventy-five male SD rats were randomlydivided into the sham operation group(n=15)and the model group(n=60).Hyper
6、tensive rat model was established by twokidneys and one clip method.Model rats were randomly divided into the control group(0.1 mL/kg ultra-pure water),thebutyrate high-dose group(220 mg/kg),the butyrate low-dose group(110 mg/kg)and the valsartan group(30 mg/kg),with 15rats in each group.Rats were g
7、iven intervention by cntinuous gavage for 4 weeks.Caudal artery systolic blood pressure(SBP)and heart rate(HR)were measured before and after administration.The serum levels of interleukin-6(IL-6),tumornecrosis factor-(TNF-)and endothelial nitric oxide synthase(eNOS)were detected by enzyme-linked imm
8、unosorbentassay(ELISA).The mRNA expression levels of IL-6,TNF-and eNOS in thoracic aorta were detected by real-timefluorescentquantitativePCR(qPCR).TheexpressionofGPR41/43inratthoracicaortawasdetectedbyimmunohistochemistry.ResultsAfter 2 weeks of administration,SBP was significantly higher in the co
9、ntrol group thanthat in the sham operation group(P0.05).Values of SBP were significantly lower in the high dose butyrate group,the lowdose butyrate group and the valsartan group than those in the control group,and SBP was significantly lower in the butyratehigh dose group than that of the butyrate l
10、ow dose group(P0.05).After 4 weeks of administration,SBP was significantlylower in the high dose group than that in the low dose group(P0.05).There were no significant differences in HR beforeand after administration between groups(P0.05).After administration,the protein expression and mRNA expressi
11、on ofeNOS were increased in the butyrate high dose group and the butyrate low dose group compared with those of the controlgroup,andtheproteinexpressionandmRNAexpressionofIL-6andTNF-weredecreased(P0.05).Immunohistochemistry showed that the expression of GPR41/43 in rat thoracic aorta tissue was incr
12、eased compared with that作者单位:内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内科(邮编014010)作者简介:秦春迪(1987),女,硕士在读,主要从事心血管病方面研究。E-mail:zhiyou_通信作者E-mail:实验研究972天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期高血压是以体循环动脉压升高为特征的心血管疾病,可伴随心脏、大脑、肾脏等重要靶器官损伤,其发病机制仍未完全明确。有研究表明,肠道菌群参与了高血压和多种慢性疾病的发生与发展,调整肠道菌群可能成为降压治疗新的干预方向1。丁酸是一种短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs
13、),由肠道中未消化的碳水化合物经厌氧细菌发酵产生,能够进入血液循环2。SCFAs通过作用于G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptors,GPCRs)参与血压的调节,主要作用包括抗炎、免疫调节、影响肾素分泌、介导血管舒张等。目前研究报道了丁酸的降压作用3,但其降压机制尚未阐明。本研究采用两肾一夹(two-kidney-one-clip,2K1C)方法建立高血压大鼠模型,观察丁酸是否通过激活GPR41/43通路抑制炎性因子,减轻血管内皮功能损伤,从而降低血压。1材料与方法1.1实验动物SPF级6周龄健康雄性SD大鼠75只,体质量(18010)g,购自北京维通利华实验动物技术
14、有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011。在内蒙古科技大学包头医学院转化医学中心适应性饲养1周,饲养期间大鼠自由摄食、饮水,光照周期12 h/12 h。1.2主要试剂与仪器丁酸钠(货号V900464-25G)购自美国Sigma公司;缬沙坦(货号H20040217)购自北京诺华制药有限公司;肿瘤坏死因子 (TNF-)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号 XFR31543)、白细胞介素 6(IL-6)ELISA 试剂盒(货号 XFR30277)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)ELISA试剂盒(货号XFR30939)购自上海信帆生物科技有限公司;兔抗鼠GPR41抗体(一抗,
15、货号AF9075)购自美国Affinity公司;兔抗鼠GPR43抗体(一抗,货号bs-13536R)购自北京博奥森生物技术有限公司;SYBR Green PCR试剂盒(货号#K0223)购自美国Thermo Fisher Scientific公司;逆转录试剂盒(货号#K1622)购自美国Fermentas公司。本实验所用引物均由上海信帆生物科技有限公司合成。BP-300A大鼠无创血压测量系统(成都泰盟),ABI-7300荧光定量PCR检测仪(美国ABI公司),RT-6100酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司),CX41正置显微镜(日本OLYMPUS公司),D5100数码相机(日本NIKON公
16、司)。1.3方法1.3.1高血压动物模型构建将大鼠采用随机数字表法进行分组,15只为假手术组,其余60只为造模组,采用2K1C方法建立高血压模型。大鼠术前12 h禁食水,腹腔注射2%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)麻醉。剪毛,皮肤碘酊消毒后,取腹正中线开口,使用玻璃分针游离左肾动脉,采用内径为0.2 mm的银夹套于左肾动脉造成肾动脉狭窄。回纳肾脏后关腹、缝合,腹腔注射1次青霉素5万U预防感染。假手术组只游离左肾动脉,其余处理相同。术后 4 周大鼠尾动脉收缩压(SBP)较术前上升30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)视为高血压模型建立成功4。1.3.2分组及给药将60只成模鼠随机分为
17、对照组、丁酸高剂量组、丁酸低剂量组和缬沙坦组,每组15只。丁酸高、低剂量组分别给予丁酸钠220 mg/kg和110 mg/kg灌胃,缬沙坦组给予缬沙坦30 mg/kg灌胃,对照组及假手术组给予超纯水(0.1 mL/kg)灌胃,每日1次,连续干预4周。1.3.3SBP及心率(HR)测量利用动物无创血压测量仪对各组大鼠自术前至末次给药每周测量尾动脉的SBP和HR。预热血压测量机器后,将加压套置于鼠尾根部,传感器贴紧鼠尾。待大鼠脉搏稳定后,连续测量3次,每次间隔不少于1 min,记录并计算SBP和HR平均值。1.3.4大鼠血清及胸主动脉标本留取末次给药12 h后,使用2%戊巴比妥钠(1.5 mL/k
18、g)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后剪毛,取5 mL腹主动脉血置于采血管,3 000 r/min离心10 min后,取血清于-80 保存。处死大鼠,剪下胸主动脉,用生理盐水灌洗胸主动脉至腔内无残余血液。将其二等分,置于-80 冰箱保存或 4%多聚甲醛固定,用于定量 PCR(qPCR)及免疫组织化学(IHC)染色。1.3.5ELISA检测大鼠血清中eNOS、IL-6、TNF-表达取1 mL大鼠血清,按ELISA试剂盒说明书步骤检测大鼠血清中eNOS、IL-6、TNF-蛋白表达水平。每组 15 个样本进行实验。1.3.6qPCR检测eNOS、IL-6、TNF-mRNA 表达取大鼠胸主动脉组织,提取组织总R
19、NA。按反转录试剂盒说明书合成cDNA 后进行扩增。采集荧光信号40个循环。eNOS引物:上游5-CTTTCGGAAGGCGTTTGAC-3,下游5-AACTCTTGTGCTGCTCAGG-3;IL-6 引 物:上 游 5-CACCAGGAACGAAAGTCAAC-3,下 游 5-CAGTGGCTGTCAACAACATC-3;TNF-引物:上游 5-TGGCGTGTTCATCCGTTC-3,下游5-CTACTTCAGCGTCTCGTGTG-3;内参GAPDH引物:上 游 5-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3,下 游 5-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3。目的基因的相对表达水
20、平用2-Ct表示。每组取5个样本进行实验。1.3.7IHC 染色检测大鼠胸主动脉组织中 GPR41/43 的表达情况取4%多聚甲醛固定的胸主动脉标本,每组5个,梯度乙醇脱水,石蜡包埋后切片。常规脱蜡,水化后抗原修复,加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,湿盒孵育,用PBS清洗,弃去PBS,加非免疫、正常羊血清封闭非特异性抗原,37 湿盒孵育 30 min,PBS 清洗后分别滴加抗体 GPR41 或 GPR43of the control group,and which was higher than that in the valsartan group(P0.05).ConclusionBut
21、yrate has asignificant antihypertensive effect on hypertensive rats,which may be related to the activation of GPR41/43 pathway toincrease vasodilation and inhibit expression of inflammatory factors.Key words:butyrates;hypertension;receptors,G-protein-coupled;interleukin-6;tumor necrosis factor-alpha
22、;nitricoxide synthase type 973Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9(一抗),4 孵育过夜。PBS 清洗后加广谱二抗,37 孵育 60 min,PBS洗清3次,DAB显色,苏木素复染,脱水、透明后中性树胶封片。每张切片随机读取3个视野,使用ImagePro Plus 6.0测量阳性染色面积(A)和积分光密度(IOD),计算平均光密度(MOD),MODIOD/A。1.4统计学方法采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料以均数标准差(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用LSD-t检验,以P0.05
23、为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠 SBP 和 HR 比较造模前各组大鼠SBP差异均无统计学意义(P0.05);造模4周,所有成模鼠SBP较假手术组均升高(P0.05);给药2周,缬沙坦组,丁酸高、低剂量组SBP较对照组降低,且丁酸高剂量组低于低剂量组(P0.05),丁酸高、低剂量组与缬沙坦组差异无统计学意义(P0.05)。给药 4 周,丁酸高剂量组 SBP 低于低剂量组(P0.05),与缬沙坦组差异无统计学意义(P0.05)。见表1。给药前后各组大鼠HR差异均无统计学意义(P0.05)。见表2。2.2各组大鼠eNOS、IL-6、TNF-水平比较与对照组相比,缬沙坦组及丁酸高、低剂量组e
24、NOS表达水平均增加(P0.05);丁酸高剂量组与低剂量组、缬沙坦组差异无统计学意义(P0.05),但丁酸低剂量组低于缬沙坦组(P0.05)。与对照组相比,丁酸高、低剂量及缬沙坦组IL-6、TNF-表达水平均降低(P0.05);丁酸高、低剂量组与缬沙坦组IL-6水平比较差异无统计学意义(P0.05),但丁酸高剂量组低于低剂量组(P0.05)。丁酸高剂量组TNF-水平低于低剂量组及缬沙坦组,丁酸低剂量组高于缬沙坦组(P0.05)。见表3。2.3各组大鼠eNOS、IL-6、TNF-mRNA相对表达量比较各组大鼠胸主动脉组织eNOS、IL-6、TNF-mRNA相对表达量的比较变化与血清蛋白检测结果一
25、致。见表4。2.4各组大鼠胸主动脉GPR41、GPR43表达量的比较IHC染色显示,对照组与假手术组相比,GPR41表达量差异无统计学意义(P0.05);与假手术组及对照组相比,丁酸高、低剂量组及缬沙坦组均升高,且丁酸高、低剂量组均高于缬沙坦组(P0.05)。假手术组、对照组及缬沙坦组GPR43表达量差异无统计学意义(P0.05);丁酸高、低剂量组均高于假手术组、对照组及缬沙坦组,且丁酸高剂量组高于低剂量组(P0.05)。见图1、表5。组别假手术组对照组缬沙坦组丁酸低剂量组丁酸高剂量组F造模前100.37.299.76.8100.67.8101.65.6100.45.50.181造模4周100
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