血浆外泌体中铁蛋白和转铁蛋白受体水平与帕金森病相关性研究.pdf
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1、临床研究血浆外泌体中铁蛋白和转铁蛋白受体水平与帕金森病相关性研究福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院神经内科(福州 )赵振华潘楚锥雷丽平汪银洲基金项目:福建省自然科学基金项目(J )通信作者,E m a i l:w p h d c o m【摘要】目的探讨血浆外泌体中铁蛋白和转铁蛋白水平与帕金森病之间的关系.方法收集 年 月至 年 月就诊于福建省立医院的 例P D患者,同时纳入 例健康对照组,抽取两组受试者血浆,提取血浆中的外泌体,采用E L I S A方法对P D患者和对照组的血浆外泌体中的铁蛋白和转铁蛋白受体进行定量分析,分析以上指标与帕金森的病程及H o e h n Y a h r(H
2、 Y)分级的相关性.结果P D患者血浆外泌体中铁蛋白水平较对照组明显升高()n g/gv s()n g/g,P ,血浆 外泌 体 中的 转铁 蛋白 受 体水 平与 对 照组 之间 差异 无 统 计 学 意 义()n g/gv s()n g/g,P .P D患者血浆外泌体中铁蛋白及转铁蛋白受体水平与P D患者的H Y分级无明显相关性(P分别为 和 ).P D患者的病程与血浆外泌体中的铁蛋白或T f R水平的相关性分析,差异均无统计学意义(P分别为 或 ).结论外周铁代谢紊乱可能参与了P D发生,但与疾病进展关系尚不明确,外泌体中铁蛋白可能成为帕金森病的外周血生物标志物.【关键词】帕金森病;外泌体
3、;铁蛋白;转铁蛋白受体【中图分类号】R 【文献标识码】B【文章编号】()T h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nf e r r i t i na n dt r a n s f e r r i nr e c e p t o r l e v e l s i np l a s m ae x o s o m e sa n dP a r k i n s o n sd i s e a s eZHA OZ h e n h u a,P AN C h u z h u i,L E IL i p i n g,WANGY i n z h o uD e p a r t m e
4、 n to f N e u r o l o g y,F u j i a nP r o v i n c i a lH o s p i t a l,P r o v i n c i a lC l i n i c a lC o l l e g eo fF u j i a nM e d i c a lU n i v e r s i t y,F u z h o u,F u j i a n ,C h i n a【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n
5、t h el e v e l so ff e r r i t i na n dt r a n s f e r r i ni np l a s m ae x o s o m e sa n dP a r k i n s o n sd i s e a s e M e t h o d s At o t a lo f p a t i e n t sw i t hP Di nF u j i a nP r o v i n c i a lH o s p i t a l f r o m O c t o b e r t oO c t o b e r w e r ec o l l e c t e d,a n d h
6、 e a l t h y c o n t r o l sw e r e e n r o l l e da t t h e s a m e t i m e T h ep l a s m ao f t h e t w og r o u p sw a s e x t r a c t e da n d t h ee x o s o m e sw e r ee x t r a c t e d T h ef e r r i t i na n dt r a n s f e r r i nr e c e p t o r si nt h ep l a s m ae x o s o m e so fP Dp a
7、t i e n t sa n dt h ec o n t r o lg r o u pw e r eq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e db yE L I S A T h e c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e a b o v e i n d e x e s,t h e c o u r s e o fP a r k i n s o n sd i s e a s e a n d t h eH Ys t a g ew a s a n a l y z e d R e s u l t s C o m p a r
8、 e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u p,t h e l e v e l o f f e r r i t i n i n t h ep l a s m a e x o s o m e s o fP Dp a t i e n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r()n g/gv s()n g/g,P ,a n d t h e r ew a sn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei nt h e l e v e l o f t r a n s f e
9、r r i nr e c e p t o rb e t w e e nt h e t w og r o u p s()n g/gv s()n g/g,P T h e r ew a sn os i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e l e v e l o f f e r r i t i na n d t r a n s f e r r i nr e c e p t o r i n t h ep l a s m a e x o s o m e s a n d t h ec o u r s eo f d i s e
10、a s e o rH Ys t a g e o fP Dp a t i e n t s(P a n d ,r e s p e c t i v e l y)T h e r ew a sn o s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ed u r a t i o no fP Da n dt h e l e v e l so f f e r r i t i no rT f Ri np l a s m ae x o s o m e s(P a n d ,r e s p e c t i v e l y)C o n c l u
11、 s i o n T h ed i s o r d e ro f p e r i p h e r a l i r o nm e t a b o l i s m m a yb e i n v o l v e d i n t h eo c c u r r e n c eo fP D,b u t t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n f e r r i t i na n dd i s e a s ep r o g r e s s i o n i sn o t c l e a r F e r r i t i n i np l a s m ae x o s
12、 o m e sm a yb eab i o m a r k e ro fP a r k i n s o n sd i s e a s e【K e yw o r d s】P a r k i n s o n sd i s e a s e;e x o s o m e s;f e r r i t i n;t r a n s f e r r i nr e c e p t o r帕金森病(P a r k i n s o n sd i s e a s e,P D)是一种以锥体外系运动症状为主要表现的第二大神经退行性疾病.该病特异性病理表现在经典临床表现出现之前已经出现,P D运动症状直到近 的多巴胺神经元
13、死亡才明显出现.由于早期缺乏合适的疾病生物标志物和明显的临床症状,早期P D容易被误诊.因此,寻找适用于早期诊断的生物标记物仍然是研究的热点.研究认为脑脊液可作为获得P D生物标志物的准确可靠的来源.然而脑脊液样本的采集是一个繁琐的过程,血液是临床应用中更可行的生物标志物的来源.外泌体含有蛋白质和细胞来源的其他成分,中枢神经系统的外泌体可以通福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o 过血脑屏障进入外周,将蛋白质从神经元转移到脑脊液或进入外周血,这些蛋白质成分可能包含过量有毒或不溶性结构分子,如与P D发病相关的 突触核蛋白.但P D
14、患者血浆外泌体中铁蛋白和转铁蛋白的水平尚不明确.在本研究中,我们从血浆中提取外泌体,检测了血浆外泌体中铁蛋白和转铁蛋白受体(T r a n s f e r r i nR e c e p t o r,T f R)水平,评估它们与P D潜在的关联,并评估它们作为该疾病的生物标志物的可行性.资料与方法 一般资料:选择 年 月至 年 月,我科招募的 例P D患者.所有P D患者均符合国际运动障碍学会的帕金森病临床诊断标准.健康对照组为患者的丈夫或妻子,或健康的社区志愿者.对照组的个体无神经系统疾病的迹象或症状.排除标准:)肿瘤;)特发性震颤、继发性帕金森病或帕金森叠加综合征;)严重颅脑创伤;)存在外周
15、或者中枢神经系统炎症,传染性或自身免疫性疾病;)严重系统性疾病,如贫血、肝病、心力衰竭、肺部疾病和慢性肾功能衰竭;)其他神经退行性疾病.P D组男 例,女 例,年龄 ()岁;对照组男 例,女 例,年龄 ()岁.两组性别、年龄差异无统计学意义(均P ).P D组,病程 ()年,H o e h n Y a h r(H Y)分级()级.本研究经福建省立医院伦理委员会批准.实验室的工作人员和统计分析师都不知晓任何临床资料和分组信息.所有研究对象均签署知情同意书.所有P D组和对照组都接受了包括病史、体格检查、神经系统查体、实验室测试和神经心理评估在内的一系列评估.实验室评价包括血液常规参数、血清电解质
16、、血尿素氮、肌酐、空腹血糖、维生素B 和促甲状腺激素,所有研究对象的上述实验室结果均为正常结果.所有P D患者均采用H Y分级进行评估,并收集患者的病程.本研究纳入研究对象后,于上午空腹采集外周静脉血m L,g室温离心 m i n,上清即为血浆,分装保存于.方法:血浆外泌体的分离:根据说明书,采用血浆总外泌体分离试剂盒(I n v i t r o g e n,美国)分离血浆外泌体.取冻存的样品,水浴完全化冻后,室温,g,离心 m i n,吸取上清,将上清室温,g,离心 m i n,取 L上清加入 LP B S缓冲液,涡旋混匀后,加入 L的提取试剂涡旋,室温静置 m i n后,室温,g,离心m
17、i n,去除上清,加入 LP B S溶解.加入 L的含有蛋白酶酶抑制剂的 T r i t o nX 的P B S缓冲液,室温静置m i n.分装后保存于.透射电子纤 维镜:将提取的外 泌 体 置 于 戊二醛中,在 固定h.样品在 MP B S缓冲液中洗涤,并在的四氧化锇溶液中固 定h.将 样 品 在 梯 度 浓 度 的 酒 精(、和 ,重复次)中脱水 m i n,然后分别用酒精环氧丙烷()和环氧丙烷在室温下渗透 m i n.样品包埋在Q u e t o l 环氧树脂中,在 聚合h,聚合h,聚合 h.用U C 超微切片机(L e i c a,德国)切割超薄切片,然后在室温下用醋酸铀染色 m i
18、n.结果在 k V的T e c n a iS p i r i t透 射 电 子 显 微 镜(F E I,美国)中观察.外泌体蛋白的铁蛋白和T f R的E L I S A定量分析:采用二喹啉甲酸法进行的血浆外泌体的总蛋白定量结果作为内参.根据试剂盒说明书,应用人铁蛋白和T f R的E L I S A试剂盒(R&D公司,美国)对血浆外泌体中的铁蛋白和T f R水平进行定量检测,并重复检测次,目标蛋白水平E L I S A检测结果的平均值/外泌体的总蛋白浓度.统计学分析:在本研究中,使用S P S S 进行统计学分析.计量资料以xs表示,两组均数比较采用独立样本t检验;两组百分率的比较采用检验.采用
19、P e a r s o n相关性分析来评估病程和H Y分级的相关性、铁蛋白及T f R水平与病程和H Y分 级 的 相 关 性.P 为 差 异 有 统 计 学意义.结果 两组血浆外泌体中的铁蛋白和T f R的比较:提取的外泌体经醋酸铀负染,透射电子显微镜下拍照,显示外泌体表现典型的双侧膜结构,茶托状,直径 在 n m左 右(图).裂 解 外 泌 体 后,E L I S A检测外泌体中的铁蛋白和T f R浓度,结果示P D组血浆外泌体中的铁蛋白水平高于对照组,差异有统计学意义(P ),P D组血浆外泌体中的T f R水平和对照组相比,差异无统计学意义(P ).见表.福建医药杂志 年月第 卷第期F
20、 u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o 图透射电子显微镜的外泌体典型图示表两组受试者血浆外泌体中的铁蛋白和T f R的比较(n g/g,xs)指标对照组P D组t值P值铁蛋白 T f R P D组疾病严重程度与血浆外泌体中的铁蛋白和T f R水平的相关性分析:P D组患者的H Y分期与血浆外泌体中的铁蛋白和T f R水平无明显相关性(P分别为 和 ).P D组患者的病程与血浆外泌体中的铁蛋白或T f R水平的相关性分析,差异均无统计学意义(P分别为 和 ).讨论铁的异常代谢目前被认为是P D的发病机制之一.当体内铁浓度超过转铁蛋白的转运能力时,过量的铁使新陈代
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