2018—2020年黔东南少数民族自治州肠道病毒A71型基因特征分析.pdf
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1、目的对2 0 18 一2 0 2 0 年黔东南州手足口病(hand,f o o t a n d m o u t h d i s e a s e,H FM D)进行鉴定分析,并对肠道病毒A组7 1型(enterovirusA71,EV-A 7 1)VP1编码区进行基因特征分析。方法2 0 18 2 0 2 0 年黔东南州共采集HFMD病例标本2789份,首先,采用荧光定量RT-PCR初筛肠道病毒核酸,阳性病例标本采用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞进行病毒分离,对分离到的病毒株提取病毒核酸,经RT-PCR方法扩增VP1编码区核苷酸序列并进行序列测定。使用M
2、EGA11.0软件构建遗传进化树进行基因特征分析。结果2 7 8 9份HFMD标本中检出EV-A71核酸阳性标本为32 8 份,阳性率为11.8%。从部分EV-71阳性患者的咽拭子及肛拭子中,分离培养获得7 株病毒株,其中6 株来自于轻症病例,另1株为重症病例,均属于EV-A71基因型C4a基因亚型,分成2 个不同的簇。7 株EV-A71VP1序列之间核苷酸和氨基酸同源性分别为8 9.8%99.9%和98.0%99.7%;与BrCr原型参考株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为7 7.1%7 8.8%和94.8%96.6%;并在VP1有18 处氨基酸位点发生变异。结论2 0 18 一2 0 2 0
3、年黔东南州EV-A71分离株属于C4a基因亚型,多处氨基酸位点存在变异,可导致多条传播链循环。关键词:肠道病毒;肠道病毒A组7 1型(EV-A71;基因型;手足口病(HFMD)中图分类号:R373.2*5文献标识码:A文章编号:16 7 3-7 58 X(2 0 2 3)0 4-0 2 2 2-0 6Genetic characteristics of enterovirus A71 in Qiandongnan Miao and DongAutonomous Prefecture from 2018 to 2020XIAO Jun*,SHAN Zhuzhou,JIANG Zhongjing,
4、PEI Fengfeng,WANG Yu,TANG Xiaomin*Qiandongnan Center for Disease Control and Prevention,Qiandongnan,Guizhou 556000,ChinaCorresponding author:TANG Xiaomin,E-mail:WANG Yu,E-mail:Abstract:Objective To identify and analyze the hand,foot,and mouth disease(HFMD)in QiandongnanPrefecture from 2018 to 2020,a
5、nd analyze the genetic characteristics of VP1 coding region of enterovirusA71(EV-A71).Methods A total of 2 789 HFMD case specimens were collected in Qiandongnan Prefecturefrom 2018 to 2020.First,fluorescent quantitative RT-PCR was used to screen the enterovirus nucleic acid.The positive case samples
6、 were isolated from human rhabdomyosarcoma(RD)cells,and the virus nucleicacid was extracted from the isolated virus strain.The nucleotide sequence of VP1 coding region was基金项目:国家自然科学基金项目(8 18 6 0 594);贵州省科技计划项目(黔科合基础2 0 18 10 94);筑科合同2 0 2 1 43-25号作者简介:肖俊(198 5一),男,湖南长沙人,副主任技师,研究方向为实验室监测。通信作者:唐小敏,E-
7、mail:57 0 8 1910 7 q q.c o m;王宇,E-mail:amplified by RT-PCRRand sequenced.Geneticphylogenetic trees were constructed by MEGA 11.0software for gene feature analysis.Results Amongthe 2 789 HFMD samples,328 were positive for EV-A71 nucleic acid,with a 11.8%positivity rate.Fromthroat swabs and anal swabs
8、 of some EV-71positive patients,7 virus strains were isolated and223Applied Prev Med,Aug.2023,Vol.29 No.42023年8 月第2 9 卷第4期应用预防医学cultured,and 6 of them were mild cases and one was severe case,all of which belonged to the EV-A71genotype C4a gene subtype,divided into 2 distinct clusters.The nucleotide
9、and amino acid homology amongthe 7 strains of EV-A71 VP1 sequences were 89.8%-99.9%and 98.0%-99.7%,respectively.The nucleotideand amino acid homology with the BrCr prototype reference strain were 77.1%-78.8%and 94.8%-96.6%,respectively.In addition,there were 18 amino acid positions in VP1 that mutat
10、ed.Conclusions From 2018 to2020,the EV-A71 isolates in Qiandongnan Prefecture belonged to the C4a gene subtype,and there weremutations in multiple amino acid positions,which could lead to the circulation of multiple transmission chain.Keywords:enteroviruses;enterovirus A71(EV-A71);genotype;hand,food
11、,and mouth disease(HFMD)手足口病(hand,foot andmouthdisease,HFMD)作为儿童易感的常见急性传染病,主要由多种人类肠道病毒(human enteroviruses,H EVs)病原体感染引起。HFMD典型临床症状以发热伴手、足、臀等部位出现皮疹或疱疹为主,部分病例可发展成病毒性脑膜脑炎、心肌炎、神经性肺水肿等重症并导致死亡2 。肠道病毒(enteroviruses,EV)属于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus),是一种无包膜(+)ssRNA病毒。基因组全长约7.4kb,由4种结构蛋白(VP1V P
12、4)编码,其中VP1编码蛋白位于病毒衣壳表面,含有重要中和表位,其常作为肠道病毒基因分型的重要靶基因3。肠道病毒A组7 1型(enterovirusA71,EV-A 7 1)是目前较为常见的病原体与重要血清型,常引起HFMD的暴发与流行。EV-A71基因组由两端非编码区(un-translated region,U T R)与一个开放阅读框(open reading fram,O RF)组成,ORF编码的多聚蛋白经水解、加工成为结构蛋白及酶等活性分子。依据VP1基因序列差异,EV-A71可划分为AG 7 个基因型,其中B基因型与C基因型是引起EV-A71流行的常见基因型别,B基因型包括8个基因
13、亚型,即B0B7;同样,C基因型也包括6个基因亚型,即C1C 6 4。为了降低EV-A71引起的HFMD发病率,2 0 16 年以来我国陆续推广使用3种非活性单价EV-A71疫苗5;上述疫苗的推广使用改变了HFMD主要优势病原的构成与流行趋势。黔东南州自开展HFMD实验室监测以来,持续关注不同肠道病原体引起的HFMD感染性疾病,但针对一段时间内该区域主要病原EV-A71型别演替与分子进化尚无相关研究,且疫苗接种引起群体免疫状态改变是否会引起EV-A71的变化,尚需相关实验数据进行评估。本研究以肠道病毒VP1编码区为切入点,对2 0 18 一2 0 2 0 年黔东南地区HFMD病原监测中分离到的
14、EV-A71进行型别鉴定与分子进化分析,旨在丰富和构建该地区肠道病毒基因数据库,同时为制定防控策略、开展免疫规划提供有效的实验室参考数据。1材料与方法1.1标本来源与采集黔东南地区各市(县)疑似病例按照手足口病诊断(WS5882018)6)标准来判定,HFMD病例标本为咽子和(或)肛拭子。标本采集后立即冷藏送至黔东南州疾病预防控制中心手足口病实验室进行检测;标本保存于-7 0 以下。2 0 18 一2 0 2 0 年实验室共收到2789份HFMD样本。1.2肠道病毒核酸检测HFMD临床标本经预处理,采用磁珠法核酸提取试剂(西安天隆科技有限公司生产),使用全自动核酸提取仪(西安天隆NP968)进
15、行RNA提取,操作按照说明书进行。提取RNA保存于-7 0 以下。使用达安基因股份有限公司生产的肠道病毒核酸检测试剂,采用实时荧光定量RT-PCR法检测肠道病毒:包括通用肠道病毒以及其他肠道病毒分型(EV-A71、C V-A 16、CV-A6、C V-A 10)。1.3病毒分离培养选取CT值低的EV-A71阳性病原标本送省级实验室进行病毒分离培养,所有重症和死亡病例标本需及时上送。上送标本采用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞进行病毒分离培养。将上送的阳性标本取0.1mL接种到生长良好、长成单层的RD细胞斜面培养管中,每个标本至少接种2 管,置于37、5%
16、CO,中静置培养。使用倒置显微镜观察细胞病变(cytopathiceffecte,C PE),若出现特征性CPE且病变达到7 5%时,收获并冻存;若无特征性224Applied Prev Med,Aug.2023,Vol.29 No.4应用预防医学2023年8 月第2 9 卷第4期CPE,再连续盲传2 代。病毒分离培养设1管加有细胞维持液的培养管作为阴性对照。阳性培养物保存于-7 0 以下备用。1.4VP1区RT-PCR扩增及鉴定使用德国QIAGEN公司QIAamp?ViralRNAMiniKit提取试剂从阳性分离物中提取病毒RNA,详见试剂说明书,并在RNA中加入1LRNA酶抑制剂,-7 0
17、 以下保存备用。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增病毒VP1区,所用引物参照文献7 ,引物序列为:EV71-VP1-S:5-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3,EV 7 1-V P1-A:5-A A G T C G C G A GAGCTGTCTTC-3。使用 SuperScript?II One-StepRT-PCR Platinum?Taq HiFi 试剂(Invitrogen byLife Technologies)进行RT-PCR扩增,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定
18、,阳性产物送擎科生物基因测序服务公司进行测序。1.5序列分析使用DNAstar7.1软件对VP1序列进行编辑和拼接,通过Enterovirus GenotypingToolVersion 0.1(https:/www.rivm.nl/mpf/typingtool/enterovirus/)进行分子分型鉴定。从GenBank数据库中下载肠道病毒参考株基因序列,使用BioEdit7.0软件进行多序列比对,采用MEGA11.0软件通过Neighbor-joining 法(1 0 0 0 bootstraps),选择MaximumCompositeLikelihood核苷酸替代模型分析与构建基因亲缘关
19、系进化树。2结果2.1HFMD病原学检测2018一2 0 2 0 年黔东南州共采集HFMD样本2 7 8 9份,肠道病毒核酸阳性标本18 36 份,阳性率为6 5.8%。男、女性检测份数分别为17 52、10 37 份,性别比为1.6 9:1。7 岁以下儿童检测份数为2 7 15份,占检测总数的97.3%,检测出的核酸阳性数为17 8 9份,占阳性标本数的97.4%。EV-A 7 1核酸阳性数为32 8 份(32 8/2 7 8 9,11.8%),感染EV-A71聚集性病例的阳性数为139份(139/2 7 8 9,5.0%),EV-A71导致的重症病例为15例。见表1。表12018一2 0
20、2 0 年黔东南地区HFMD病原学检测情况EVEV-A71EV-A71聚集性病例年份检测份数EV-A71重症病例阳性例数阳性率(%)阳性例数阳性率(%)阳性例数阳性率(%)2018118168558.0716.0312.64201991664770.6616.7272.98202069250472.819628.38111.73合计2.789183665.832811.81395.0152.2病毒分离与鉴定2018一2 0 2 0 年从上送的109份EV-A71阳性病例中,选取核酸检测CT值25的病原标本进行病毒分离培养,得到7 株阳性培养物,分别为2 0 18 年2 株、2 0 19年2 株
21、、2 0 2 0 年3株,其中1株为重症患者中分离。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,约在10 0 0 bp处检测到目的条带,对目的片段进行测序,经DNAstar7.1软件拼接出7 条VP1基因全序列。通过EnterovirusGenotypingToolVersion0.1初筛比对,7 株病毒分离物均为EV-A71基因型C4a基因亚型。2.31EV-A71VP1基因亲缘性关系基于肠道病毒VP1基因全序列,黔东南地区7 条病毒株序列与EV-A71A、B、C 亚型参考株构建基因亲缘性关系树。见图1A。结果表明,7 株EV-A71分离株均与C4a基因亚型同聚一簇,与EnterovirusGenotyp
22、ingToolVersion0.1初筛比对结果一致,并且分成2 个不同的簇:2 0 19年分离株独立聚于成簇;2 0 2 0 年从重症患者中分离的SZK2020QDN-1-002毒株与2018和2 0 2 0 年的轻症病例分离株同聚一簇。EV-A71黔东南分离株与周边黔南州、遵义市、铜仁市、黔西南州及其各基因亚型代表株构建基因亲缘性关系树。见图1B。结果表明,重症病例SZK2020QDN-1-002分离株与2 0 19年黔西南重症病例分离株(SZK2019QXN323、S Z K 2 0 19Q X N47 3)同聚一簇;而2 0 19 年黔南重症病例分离株(S Z K 2 0 19Q N36
23、 2)与本研究2 0 19年2 株轻症病例分离株同聚一簇。2.4EV-A71VP1基因同源性与氨基酸位点变异分析2 0 18 2 0 2 0 年该地区7 株EV-A71VP1基因间核苷酸与氨基酸同源性分别为8 9.8%99.9%和98.0%99.7%;与BrCr原型参考株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为7 7.1%7 8.8%和94.8%225Applied Prev Med,Aug.2023,Vol.29 No.42023年8 月第2 9 卷第4期应用预防医学A99SZK2020QDN-1-002-EV-A71(C4a)BSZK2020QN-08-030-EV-A71-C4a97SZK202
24、0QN-08-042-EV-A71-C4a98SZK2020QDN-8-086-EV-A71-C4aSZK2020TR-09-0112-EV-A71-C4a10097SZK2020QDN-8-085-EV-A71-C4aSZK2020QDN-8-085-EV-A71-C4aSZK2018QDN678-EV-A71(C4a)65SZK2020QDN-1-002-EV-A71(C4a)SZK2018QDN679-EV-A71(C4a)99SZK2020QDN-8-086-EV-A71-C4aSZK2019QXN473-EV-A71(C4a)94518-03F/SD/CHN/2007-C4aSZK2
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