万峰湖丰水期和枯水期细菌群落组成和多样性比较.pdf
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1、第 38 卷第 3 期大大 连连 海海 洋洋 大大 学学 学学 报报Vol.38 No.32 0 2 3 年 6 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYJune 2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-276文章编号:2095-1388(2023)03-0414-09万峰湖丰水期和枯水期细菌群落组成和多样性比较秦燕,范波,梅丽(兴义民族师范学院 生物与化学学院,贵州 兴义 562400)摘要:为比较贵州省黔西南州万峰湖丰水期和枯水期细菌群落组成和多样性,于 2020 年 11 月(丰水期)和 2021 年 5 月(枯水期)采集了万峰
2、湖 3 个生态位点(大坝、梅家湾和巴结)表层(05 m)水体的水样,采用 16S rRNA 高通量测序技术分析其群落组成。结果表明:3 个取样点丰水期细菌的 OTUs 共1 647 个,枯水期细菌的 OTUs 共 1 530 个,枯水期细菌丰度高于丰水期,而丰水期细菌群落多样性高于枯水期;在门水平上,丰水期浮游细菌群落主要由变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和蓝藻门(Cyanobacteria)等 18 门 202 属细菌组成,枯水期浮游细菌群落则主要由放线菌门、变形菌门和拟杆菌门(Bacteroidetes)等 20 门 236 属细菌组成;在
3、属水平上,丰水期和枯水期共有属为 55 属,147 属为丰水期特有,其中放线菌门的 Nanopelagicaceae 属、蓝菌属(Cyanobium)和羊栖菜弧菌属(Limnohabitans)丰度最高,181 属为枯水期特有,其中蓝藻门的 Gplla 属、土生单胞菌属(Terrimonas)和玫瑰单胞菌属(Roseomonas)丰度最高;PICRUSt 功能预测显示,大部分代谢途径中菌群预测的基因拷贝数为枯水期明显高于丰水期。研究表明,万峰湖丰水期和枯水期细菌群落组成和多样性存在明显差异,丰水期和枯水期均有其特有的细菌群落结构,且枯水期菌群代谢比丰水期更活跃。关键词:万峰湖;细菌组成;16S
4、 rRNA;高通量测序;丰水期;枯水期中图分类号:S 917;Q 179.1 文献标志码:A 贵州省黔西南州的万峰湖位于桂、黔和滇三省交界处,是建设国家重点项目天生桥水电站形成的湖泊,蓄水量丰富,可达 102.6 亿 m3,湖区面积达 176 km2,是黔西南地区最大的人工湖泊。万峰湖沿岸森林密布,少有农田,绿色生态旅游及生态养殖业发展迅速,因此,万峰湖的生态保护对珠江流域的水资源开发具有重要意义。目前,有关万峰湖的研究大多集中在浮游植物调查及水质评估1,而基于高通量测序技术的万峰湖生物群落结构及水质监测尚未见报道。水生环境中聚集了最丰富的基因、酶和天然产物资源,微生物群落是生物地球化学循环和
5、污染物生物降解的基础,在水生生态系统中具有非常重要的作用。评估水体系统中微生物群落结构的动态变化,调查水生环境中微生物的群落组成对开发和保护水资源意义重大。前期许多研究均指出,湖泊水体中细菌群落结构会发生明显的季节性变化,如刘兰英等2揭示了福州左海湖细菌群落具有明显的季节性变化特征,且发现季节动态与水温、营养状况密切相关;沈烽等3研究发现,南京玄武湖浮游细菌群落结构存在明显的季节变化,影响玄武湖细菌群落结构最显著的环境因子为温度;邢鹏等4研究表明,太湖的细菌种群多样性也存在明显的季节变化规律,夏季及秋季浮游细菌的丰度、多样性及种群的均匀度明显高于冬季和春季;Ji 等5研究表明,武汉 3 个富营
6、养化湖泊的细菌富营养化指数和温度是影响湖水中细菌群落组成的主要因素;Paruch等6也认为,温度是影响细菌群落组成的主要非生物因素。这些研究结果均表明,在许多湖泊中细菌群落会发生季节性演替,动态跟踪水质的变化对全面了解水生微生物多样性、组成和动态,以及对于可持续生态系统功能的水质评估、预测和管理策略至关重要。基于 16S rRNA 的高通量测序(next-generation 收稿日期:2022-10-24 基金项目:贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合 KY 字【2019】221 号);兴义民族师范学院博士科研基金(18XYBS02);黔西南州 2019 年州级科技计划自筹基金(2019
7、-2-50)作者简介:秦燕(1980),女,博士,副教授。E-mail:qinyan1024 sequencing)技术为探索水生环境中细菌群落提供了便利的技术手段。高通量测序技术不仅能精细表征细菌的基因组,而且可以更深入地对复杂细菌群落进行分类鉴定,利用 NGS 方法目前已对国内多个水域环境中的细菌群落进行了调查,如江苏太湖与阳澄湖7、贵州赤水河8、江西鄱阳湖9、河北白洋淀10、湖北梁子湖与后官湖11、南京花神湖与紫霞湖12及内蒙古达里诺尔湖13等。本研究中,首次利用 16S rRNA 基因通过 Illumina 二代测序技术,对万峰湖主航道各区段 3 个位点在丰水期和枯水期的细菌群落结构进
8、行了调查,以期为进一步研究该湖泊的群落结构动态变化及其生态功能提供数据参考。1 材料与方法1.1 调查区域及采样站位于 2020 年 10 月(丰水期)和 2021 年 5 月(枯水期)在万峰湖 3 个采样点采集表层(0 5 m)水样,3 个采样点分别为大坝(10510E、2494N,记为 DB)、梅家湾(10508E、2490N,记为 MJW)和巴结(10503E、2487N,记为 BJ),采样点位分布见图 1。本图以自然资源部标准地图服务网站 GS(2019)3333 号标准地图为底图,底图边界无修改。The figure is based on the standard map GS(2
9、019)3333 in the Standard Map Service website of Ministry of Natural Resources of the Peoples Republic of China,with no modifications of the boundaries in the standard map.图 1 万峰湖采样点Fig.1 Sampling sites in the Wanfeng Lake1.2 方法1.2.1样本采集与预处理用不锈钢采样器采集水样,从每个位点采集水样 5 L,分装于 5 个 1 L灭菌聚乙烯细口瓶中,水样置于冰上运输至实验室4
10、 下保存。不同水样用真空泵抽滤,滤膜直径为0.45 m,抽滤后的滤膜立即置于-80 超低温冰箱中保存。1.2.2高通量测序将过滤后的滤膜送至上海生工生物工程有限公司进行样品基因组 DNA 提取、16S rDNA 基因扩增和测序,并对数据进行多样性分析。PCR 扩增区域为 V3 V4,引物序列为341F:CCTACGGGNGGCWGCAG,805R:GAC-TACHVGGGTATCTAATCC。将 Illumina MiSeq 测序得到的原始序列(raw data)经处理后得到有效数据(clean data),采用 QIIME 软件进行生物信息学分析,根据序列的相似度,将序列归为多个 OTUs(
11、operational taxonomic units),基于 OTU 计算稀释曲线、群落丰富度指数(Chao1、Ace)、群落多样性指数(Shannon、Simpson)和群落均匀度指数(Shannoneven)等。用 PICRUSt 软件进行菌群的功能和代谢途径预测分析14,将 OTUs 在 COG 和KEGG 数据库中进行比对,获得不同的数据库功能预测信息。2 结果与分析2.1 序列信息和多样性指数对万峰湖丰水期和枯水期 3 个采样点的样本进行测序,每个采样点设置 3 个生物学重复,共得到345 947 个原始序列(raw reads),经过拼接和质控后,共得到了 344 966 个有效
12、序列(clean reads)(占原始序列的 99.71%)。之后,按照相似性对非重复序列进行 OTU 聚类,在所有样品中共得到3 177个 OTUs,样品覆盖率均为 99%以上。丰水期和枯水期细菌的 16S rRNA 基因片段总数分别为122 976、131 637,OTUs 数 目 分 别 为 1 647、1 530 个(表 1)。从表 1 可见:在所有测序样品中,枯水期 BJ样本的细菌丰度(Ace 和 Chao 1 值)最高,其次是枯水期的 DB 和 MJW 样本,而丰水期 DB 样本的细菌丰度最高;丰水期和枯水期 MJW 样本的 Shan-non 值均最高。方差分析显示,反映细菌丰度的
13、Chao 1 和 Ace 指标(P=0.008 和 0.047),反映细菌群落多样性的 Shannon 和 Simpson 指标(P=0.000 5 和 0.015),以及反映群落分布均匀度的Shannoneven 指标(P=0.002)均在丰水期和枯水期间呈现出显著差异性。说明丰水期和枯水期细菌群落结构组成有显著差别。514第 3 期秦燕,等:万峰湖丰水期和枯水期细菌群落组成和多样性比较表 1 万峰湖丰水期和枯水期细菌群落的 Alpha 多样性和丰度Tab.1 Alpha diversity and richness of bacterial community from wet seaso
14、n and dry season in the Wanfeng Lake时期period样品sample序列数number of sequenceOTU 数目number ofOTU香农指数Shannon index物种数目指数Chao 1 index基于丰度覆盖估计值Ace index辛普森指数Simpson index香农均匀度指数Shannoneven index覆盖率coverage枯水期dry seasonDB48 082.00 520 4.000.046621.181.052597.240.5510.0430.000 40.6390.0040.9980.000 5MJW39 231
15、.00 472 4.090.021567.191.716561.500.4840.0360.000 20.6640.0060.9970.000 4BJ44 323.00 539 4.010.011679.420.565644.430.8330.0430.000 60.6370.0040.9970.000 3平均值43 878.67 510 4.028 622.598 595.0570.041 0.647 0.997 丰水期wet seasonDB39 792.00 544 4.500.011575.410.878565.790.2250.0270.000 20.7140.0050.9990.0
16、00 1MJW43 312.00 547 4.630.006555.880.570558.260.2130.0210.000 80.7340.0060.9990.000 0BJ39 873.00 555 4.520.010566.150.529565.530.459 0.030 0.000 70.7160.0050.9990.000 0平均值40 992.33 549 4.550 565.814 563.192 0.0260.7210.999 P 值 P value 0.001 0.131 0.001 0.0080.0480.0150.0020.002 为了进一步展示样本中细菌多样性的不同,进
17、行了 Beta 多样性分析。从图 2 可见:丰水期 DB、BJ 和 MJW 样本间的距离较近,尤其是 BJ 与 DB,说明 3 个样本中的细菌组成相似;而枯水期的 3 个样本间距离均较远,说明 3 个样本中的细菌群落组成差别较大。图 2 丰水期和枯水期细菌群落的主坐标分析Fig.2 Principal co-ordinates analysis of bacterial com-munity in wet season and dry season2.2 丰水期及枯水期细菌群落结构比较样品的稀释曲线显示(图 3(a)、(b),万峰湖丰水期的 BJ、DB 和 MJW 3 个样本中 OTUs 均显
18、示出较陡的稀释曲线,而枯水期样本 OTUs 的稀释曲线较平缓,这表明,丰水期和枯水期样本序列较好地反映了细菌群落的种类和数量,样品均为随机取样,其中,丰水期基本涵盖了全部细菌群落的多样性,枯水期可能还蕴藏着一些未被鉴定的微生物资源。对丰水期和枯水期细菌群落的 OTUs 韦恩图(图 3(c)、(d)分析显示:丰水期 3 个样本有共同的 485 个 OTUs,BJ 样本特有的 OTUs 最多(12 个),而 MJW 和 DB 样本特有的 OTUs 分别为5个和 2 个;枯水期 3 个样本有共同的 358 个 OTUs,BJ 样本特有 OTUs 最多(84 个),MJW 和 DB 样本特有的 OTU
19、s 分别为 50 个和 33 个。这表明,3 个样本具有较多共同的细菌。通过 RDP(ribosomal database project)法分析万峰湖丰水期和枯水期细菌的 1 647 个/1 530 个OTUs 分类,结果表明,丰水期细菌总数为 122 976的序列隶属于 18 个门 202 属,枯水期细菌总数为131 637 的序列隶属于 20 个门 236 属。UPGMA 分析和相对丰度比较如图 3 所示。从门水平上对丰水期和枯水期细菌群落结构比较发现:丰水期 3 个样本中变形菌门(Proteobacteria)最为丰富,其次是放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyano
20、bacte-ria)、拟 杆 菌 门(Bacteroidetes)、浮 霉 菌 门(Planctomycetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia);枯水期 3 个样本中放线菌门最丰富,其次是变形菌门、拟杆菌门、蓝藻门、浮霉菌门和疣微菌门,并在枯水期 BJ 样本中发现了其特有的装甲菌门(Ar-matimonadetes);从样本间的细菌丰度分布差异程度的距离热图可见,BJ 和 DB 样本间的距离关系较近(图 4)。通过分析发现,同一时期 3 个样本中的主要细菌组成和数量相似,因此,后续的分析只选取其中一个取样点的样本进行比较。以 BJ 样本为例,比较丰水期和枯水期丰度最高的前 8 个
21、门发现:两个时期细菌结构组成基本相同,枯水期有 1 个独有的装甲 菌 门;丰 水 期 细 菌 群 落 涵 盖 的 未 知 菌 群(42.00%)远大于枯水期(1.60%)(表 2)。尽管变形菌门、放线菌门、蓝藻门和拟杆菌门均为丰水期和枯水期的优势菌群,但两个时期这些菌群的相614大连海洋大学学报 第 38 卷图 3 丰水期和枯水期细菌群落的 OTUs 分析 Fig.3 OTUs analysis of bacterial community in wet season and dry season 图 4 门水平上丰水期和枯水期细菌群落的种类和相对丰度比较Fig.4 Comparison of
22、 species and relative abundance of bacterial community between wet season and dry season at phy-lum level对丰度差别较大,说明万峰湖丰水期和枯水期细菌群落间的丰度差异显著。以 BJ 样本为例,从属水平上对丰水期和枯水期细菌群落结构比较发现,全部细菌序列可分为438 个不同的属,其中 55 个属为丰水期和枯水期细菌所共有,大部分为单胞菌和杆菌,147 个属为丰水期所特有,181 个属为枯水期所特有(图 5)。丰水期细菌隶属于 202 个属,丰度最高的属有714第 3 期秦燕,等:万峰湖丰水期和
23、枯水期细菌群落组成和多样性比较细菌 属(Bacteria,38.8%),其 次 为 红 细 菌 属(Rhodobacteraceae,8.01%)和放线菌属(Actinomy-ces,7.48%)等;枯水期细菌隶属于 236 个属,丰度最高的属有酸微菌属(Acidimicrobidae,24.39%),其次为微球菌属(Micrococcineae,11.95%)和蓝藻门的 Gplla 属(7.58%)等(表 3)。表 2 门水平上丰水期和枯水期细菌群落组成比较(BJ 样本)Tab.2 Comparison of bacterial community composition between w
24、et season and dry season at phylum level (BJ sample)%时期period变形菌门(Proteobacteriap)放线菌门(Actinobacteria)蓝藻门(Cyanobacteria)拟杆菌门(Bacteroidetes)浮霉菌门(Planctomycetes)疣微菌门(Verrucomicrobia)其他other装甲菌门(Armatimonadetes)丰水期 wet season25.523.7614.691.308.211.083.600.223.560.592.430.5342.000.7 枯水期 dry season21.59
25、1.7843.400.4310.710.9514.143.362.760.304.041.331.600.101.750.13P 值 P value0.25 0.00 0.00 0.05 0.21 0.04 0.00 表 3 属水平上丰水期和枯水期细菌群落组成比较(BJ 样本)Tab.3 Comparison of bacterial community composition between wet season and dry season at genus level(BJ sample)%时期period浮霉菌属(Planctomycetales)伯克氏菌属(Burkholderial
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