转录组测序解析超级稻淮稻5号灌浆速率快的机理_刘喜.pdf
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1、DOI:10.13430/ki.jpgr.20221018001植物遗传资源学报 2023,24(3):854-863Journal of Plant Genetic Resources转录组测序解析超级稻淮稻5号灌浆速率快的机理刘喜1,3,王迪2,高浩2,王颖洁3,王贵枝3,王彦雁3(1淮阴师范学院江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室/江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心,淮安 223300;2江苏省徐淮地区淮阴农业科学研究所,淮安 223001;3淮阴师范学院生命科学学院,江苏淮安 223300)摘要:灌浆速率是水稻重要而复杂的农艺性状之一,直接影响产量和品质。淮稻5号是由7208
2、武育粳3号杂交后代选育而成的粳稻优良品种,具有较高的灌浆速率,但其重要的分子特征尚不清楚。对淮稻5号和武育粳3号受精后14 d的种子提取RNA进行转录组分析。采用实时荧光定量PCR分析籽粒灌浆速率相关基因的表达水平,采用Sanger测序法分析淮稻5号和武育粳3号中已克隆的灌浆速率相关基因序列差异。在淮稻5号和武育粳3号之间检测到3230个上调基因和1171个下调基因。GO富集分析表明,这些基因主要参与淀粉和蔗糖生物合成、光合作用、碳同化、激素生物合成和信号转导途径。与武育粳3号相比,淮稻5号激活了较多参与淀粉和蔗糖生物合成的基因。共检测到63个激素相关差异表达基因,其中38个基因参与生长素途径
3、,表明生长素在水稻籽粒灌浆过程中起着重要作用。一些已知的灌浆速率相关基因(GFR1、OsPFP1、OsPHO1;2、OsSWEET13、OsCIN2)在淮稻5号中显著上调。Sanger测序表明GFR1Huaidao5可能是控制灌浆速率的优异单倍型。关键词:水稻(Oryza sativa L.);淮稻5号;转录组;灌浆速率;GFR1Deciphering the Functional Mechanism of Fast Grain Filling Rate in a Super Rice Huaidao 5 by Transcriptome AnalysisLIU Xi1,3,WANG Di2,
4、GAO Hao2,WANG Ying-jie3,WANG Gui-zhi3,WANG Yan-yan3(1Huaiyin Normal University,Key Laboratory of Eco-Agricultural Biotechnology around Hongze Lake/Regional Cooperative Innovation Center for Modern Agriculture and Environmental Protection,Huaian 223300;2Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of X
5、uhuai Region in Jiangsu,Huaian 223001;3Huaiyin Normal University,School of Life Sciences,Jiangsu Huaian 223300)Abstract:Grain filling rate is an important and complex agronomic trait that directly affects rice yield and quality.Huaidao 5,a superior rice japonica variety,derived from the 7208 Wuyujin
6、g 3 cross,shows a high grain filling rate,whereas its functional mechanism remains unclear.A transcriptome analysis in Huaidao 5 and Wuyujing 3 was performed by harvesting 14-days-after-fertilization grains.Real time fluorescent quantitative PCR was used to analyze the transcripts of few candidate g
7、enes,and Sanger sequencing was applied to identify their polymorphisms between Huaidao 5 and Wuyujing 3.3230 up-regulated and 1171 down-regulated genes were detected between Huaidao 5 and Wuyujing 3.Gene ontology analysis indicated that these differentially-expressed genes were primarily involved in
8、 starch and sucrose biosynthesis,photosynthesis,carbon assimilation,and hormone biosynthesis and signaling transduction pathway.If compared to Wuyujing 3,more genes involved in starch and sucrose biosynthesis were up-regulated in Huaidao 5.Sixty-three hormone-related differentially expressed genes w
9、ere detected,of which 38 genes were involved in the auxin pathway,suggesting that auxin plays an important role in the rice grain filling process.Several identified grain-filling-rate-related genes(GFR1,收稿日期:2022-10-18 修回日期:2022-11-10 网络出版日期:2022-12-10URL:https:/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20221018001第
10、一作者研究方向为水稻遗传育种,E-mail:通信作者:刘喜,研究方向为水稻遗传育种,E-mail:王迪,研究方向为水稻遗传育种,E-mail:基金项目:江苏省自然科学基金(BK20190239,BK20191055);江苏省青蓝工程优秀青年骨干教师;淮安市农科院科研基金发展项目(HNY202002)Foundation projects:Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20190239,BK20191055);Outstanding Backbone Young Teachers of Jiangsu Qinglan Proje
11、ct;Scientific Research Fund Development Project of Huaian Academy of Agricultural Sciences(HNY202002)3 期刘喜等:转录组测序解析超级稻淮稻5号灌浆速率快的机理OsPFP1,OsPHO1;2,OsSWEET13,OsCIN2)were significantly up-regulated in Huaidao 5.Moreover,Sanger sequencing showed that GFR1Huaidao5 might be an excellent haplotype to contr
12、ol the grain filling rate.Key words:rice(Oryza sativa L.);huaidao5;transcriptome;grain filling rate;GFR1水稻是世界上最重要的粮食作物之一,提高水稻产量是保障全球粮食安全的重要目标。水稻产量主要由单株穗数、每穗粒数和粒重控制1,而粒重最重要的影响因子是灌浆速率2-3。水稻籽粒灌浆受多种内在和外在的因素影响,灌浆过程极其复杂。因此,研究水稻籽粒灌浆的内在生理生化机制,分离鉴定水稻灌浆相关基因,发掘灌浆相关基因优异单倍型,可为水稻高产优质分子育种提供理论依据。近年来,在水稻中发现并分离了许多与灌浆
13、速率相关的基因4-6。细胞壁转化酶基因 OsGIF1/OsCIN2已被鉴定为在早期灌浆阶段参与碳分配的驯化选择基因2。4 个糖转运基因 OsSWEET4、OsSWEET11、OsSWEET14和OsSWEET15是籽粒灌浆和胚乳发育所必需的7-9。此外,已发现两种NAM/ATAF/CUC(NAC)转录因子,即ONAC127和ONAC129,通过直接结合OsSWEET4的启动子正调节籽粒灌浆10。miR1432表达抑制的植株表现出增强 的 籽 粒 灌 浆 率 和 显 著 增 加 的 籽 粒 产 量3。OsPHO1;2编码磷酸转运蛋白,正调控水稻籽粒灌浆,过表达OsPHO1;2能提高水稻产量,尤其
14、是在低磷条件下11。Liu等12利用穞稻(Ludao)与粳稻恢复系C堡(C-bao)构建的近等基因系克隆了控制水稻灌浆速率的主效数量性状位点基因 GFR1。GFR1基因编码细胞膜定位蛋白,并通过与Rubisco小亚基OsRbcS相互作用,提高Rubisco活性,促进水稻籽粒灌浆12。转录组测序技术价格低廉、数据采集周期短,在水稻遗传育种研究中得到广泛应用。Kong等13利用转录组分析了籼稻和粳稻对盐胁迫反应差异的机制,并鉴定了18个盐胁迫相关候选基因。Sun等14利用转录组分析了水稻强势粒与弱势粒灌浆动态过程,鉴定到19442个差异表达基因,并发现大多数淀粉合成基因在弱势粒中的延迟表达可能是造
15、成灌浆早期弱势粒灌浆速率低的重要因素。淮稻5号是由7208武育粳3号杂交选育的超级稻品种。相比武育粳3号,淮稻5号具有较高的灌浆速率。本研究拟利用转录组解析淮稻5号灌浆速率快的内在机理,鉴定其调控灌浆速率的基因。本研究对淮稻5号与武育粳3号灌浆速率进行鉴定,选取淮稻5号与武育粳3号灌浆速率差异最大的时期取样进行转录组测序,分析鉴定差异表达基因,以期解析淮稻5号灌浆速率的内在机制,为水稻高产优质分子设计育种奠定理论基础。1材料与方法1.1试验材料粳稻品种淮稻5号(HD5,huaidao5)与武育粳3号(WYJ3,wuyujing3)。2021-2022年5月至10月种植在江苏省淮安市淮阴师范学院
16、生物科技园内。1.2农艺性状测定在成熟期分别随机选取淮稻5号与武育粳3号各10株进行农艺性状测定。人工统计测量株高、分蘖数、穗长、穗粒数和结实率。使用万深SC-G1型考种仪测量千粒重、粒长以及粒宽。取10个单株相应性状的平均值作为性状数值。采用t检验进行差异显著性分析。1.3灌浆速率测定随机选取5株生长整齐一致的淮稻5号和武育粳3号标记同一天开花的颖花,每株标记50粒颖花,在受精后第7、14、21、28和35 d从穗上收获。新鲜的籽粒样品在 105 高温干燥 30 min,然后在85 下干燥至恒重。对去壳的籽粒进行称重,根据Liu等12的方法计算灌浆速率,设置3次生物学重复。1.4转录组测序使
17、用江苏康为世纪RNApure植物试剂盒提取淮稻5号和武育粳3号的受精后14 d籽粒总RNA。然后,通过委托GENE DENOVO(中国广州)在Illumina测序平台(HiSeq2500)上构建cDNA文库测序,并通过 FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million reads mapped)评估基因表达15,设置3次生物学重复。使用DESeq2鉴定差异表达基因(DEGs,differentially expressed genes),设定的参数为|log2(Fold Change)|1和FDR0.05,利用在线软件WEGO(Web
18、Gene Ontology Annotation Plotting)进行差异表达基因的GO富集分析。1.5基因表达分析用Trizol试剂从淮稻5号和武育粳3号受精后14 d籽粒中提取总RNA,并通过实时荧光定量PCR分析淀粉和糖生物合成相关基因、灌浆速率相关基因的表达水平。用于检测这些基因表达水平的引855植物遗传资源学报24 卷物参考Liu等12和孔飞16。PCR反应体积为20 L(8.8 L稀释cDNA,1.2 L引物,10 L TB Green Premix Ex TaqII),并使用BioRad CFX96触摸实时PCR检测系统进行定量PCR。以水稻UBQ(LOC_ Os03g1317
19、0)基 因 为 对 照,正 向 引 物 序 列 为5-CTGTCAACTGCCGCAAGAAG-3,反向引物序列为-GGCGAGTGACGCTCTAGTTC-3,设置3次生物学重复。1.6灌浆速率相关基因GFR1基因型鉴定使用 Hi-DNAsecure 植物试剂盒(Cat#DP350,北京天根生化)提取淮稻5号和武育粳3号的基因组DNA,并使用KOD DNA聚合酶进行PCR。PCR程序如下:在98 下变性10 s,在55 下退火30 s,在68 下延伸2 min,33个循环。用于鉴定GFR1基因型引物见表1。PCR产物委托安徽通用生物测序。使用BioXM2.6软件对序列进行分析和比对。2结果与
20、分析2.1淮稻5号和武育粳3号主要农艺性状比较相比武育粳3号,淮稻5号株高显著增高,达到93.64 cm,提高约14%(图1A、B)。在分蘖数与穗长方面,淮稻5号与武育粳3号无显著差异(图1C、D)。淮稻5号的结实率与千粒重均显著高于武育粳3号,分别达到94.41%与28.54 g(图1E、F)。淮稻5号的穗粒数与粒长均显著高于武育粳3号,而粒宽则无差异(图1GI)。上述结果表明,相比武育粳3号,淮稻5号农艺性状具有较好的综合表现。表 1基因型鉴定所用的引物序列Table 1Primers used for genotype identification引物名称Primer nameGFR1-
21、1GFR1-2GFR1-3GFR1-4GFR1-5GFR1-6正向引物序列(53)Forward primer sequence(53)CTCGAGTTCAAGTTAAGACTACTTTAAACTTTCTTCCCATGTCACGATTCGCCGGAATTCGACAGTTGGCAATTGTCACGAGAAATCACAAAGCTCGCGAATTGCAGATTGCGCAGCTAACAT反向引物序列(53)Revers primer sequence(53)CTTACGGTTAATCGAGTATTCGAGCCGCTTCACCTCCGACCCCGCTTTTACCCAAACCAATCGAACATATCCA
22、AGCCTCCATGTTAGCTGCGCAATCTGCCGTGAAACGAGATAGGTCGT数据表示为平均值标准差(n=10);*代表在P0.01水平上差异极显著;HD5和WYJ3分别代表淮稻5号与武育粳3号;下同Data are expressed as mean SD(n=10).*represents extremely significant differences at P0.01 level;HD5 and WYJ3 represent Huaidao 5 and Wuyujing 3 respectively;The same as below图1淮稻5号与武育粳3号成熟期主要
23、农艺性状比较Fig.1Comparison of main agronomic traits between HD5 and WYJ3 at maturity8563 期刘喜等:转录组测序解析超级稻淮稻5号灌浆速率快的机理2.2淮稻5号和武育粳3号灌浆速率比较为了明确淮稻5号与武育粳3号籽粒灌浆的差异,测定了淮稻5号与武育粳3号在受精后7、14、21、28、35 d 的籽粒灌浆速率。在受精后14 d淮稻5号籽粒充实度显著高于其父本武育粳3号(图2A)。灌浆前期阶段淮稻5号的籽粒灌浆速率显著高于武育粳3号(图2B)。淮稻5号的灌浆速率在受精后14 d达到最高值1.297 mg/grain d,但
24、武育粳3号的最高灌浆速率在受精后 21 d,且仅为 0.818 mg/grain d(图2B)。在受精后21 d和28 d时,淮稻5号的籽粒灌浆速率低于武育粳3号(图2B)。2.3淮稻5号和武育粳3号差异表达基因的鉴定为了探究淮稻5号与武育粳3号之间灌浆差异的分子机制,在受精 14 d 时对淮稻 5 号与武育粳3号籽粒进行转录组分析。从6个样本中获得了总计273,164,090个Clean reads,每个样本平均45,527,348个Clean reads。6个样本的测序质量值Q30平均值为92.27%,范围为91.96%93.00%。上述测序数据表明转录组测序是成功可信的。在淮稻5号与武育
25、粳3号之间共鉴定了4401个差异表达基因。相较于武育粳3号,在淮稻5号中有3230个上调基因和1171个下调基因(图3A、B)。为了验证转录组数据的可靠性,随机选择5个上调和5个下调表达基因进行qRT-PCR分析。如图3C、D所示,qRT-PCR结果与转录组数据一致。对差异表达基因进行GO富集分析,结果显示,相比武育粳3号,在淮稻5号中上调表达的基因主要富集在代谢过程、细胞、催化活性等GO条目;在淮稻5号中下调表达的基因主要富集在代谢过程、细胞部分、催化活性、结合等GO条目(图4)。2.4淀粉和糖生物合成相关基因的转录水平分析水稻等谷物灌浆过程涉及淀粉和糖的生物合成和积累17。因此,本研究主要
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