柱前衍生化-HPLC法分析不同产地厚朴叶多糖的单糖组成.pdf
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1、 收稿日期:2 0 2 2-0 8-0 5 修回日期:2 0 2 2-0 9-3 0基金项目:中国中医科学院科技创新工程项目(C I 2 0 2 1 A 0 4 5 1 1);国家自然科学基金项目(8 1 2 0 2 9 0 3,8 1 5 7 3 5 3 4)*通讯作者:李化,女,博士,副研究员,主要从事中药及其复方的质量评价及其药效物质基础的研究.E-m a i l:l i h u a 6 2 1h o t m a i l.c o m;何宇新,男,博士,教授,主要从事中药新制剂新剂型研究.E-m a i l:H e y u x i n 6 61 2 6.c o m第3 9卷第3期V o l
2、.3 9 N o.3分 析 科 学 学 报J OUR NA LO FANA L Y T I C A LS C I E N C E2 0 2 3年6月J u n e 2 0 2 3D O I:1 0.1 3 5 2 6/j.i s s n.1 0 0 6-6 1 4 4.2 0 2 3.0 3.0 1 9柱前衍生化-H P L C法分析不同产地厚朴叶多糖的单糖组成黄国英1,2,3,林路洁1,李 玲3,何宇新*3,李 化*1,杨 滨1(1.中国中医科学院中药研究所,北京,1 0 0 7 0 0;2.成都大学附属医院药剂科,四川成都,6 1 0 0 8 1;3.西华大学食品与生物工程学院,四川成都,
3、6 1 0 0 3 9)摘 要:建立了1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(P M P)柱前衍生化-高效液相色谱法(H P L C)同时测定厚朴叶多糖中的6种单糖含量的方法。采用P h e n o m e n e x(4.6m m 2 5 0m m,4m)为色谱柱,流动相为0.2%磷酸溶液-乙腈(体积比为8 2 1 8),流速为1.0m L/m i n,检测波长为2 4 5n m,柱温为3 5。结果显示,基于H P L C法所建立的单糖检测方法,6种单糖成分在各自线性范围内线性关系良好(R2 0.9 9 9 4),平均加标回收率为9 7.1 7%1 0 0.2 2%,相对标准偏差(R S D,n=
4、6)为1.6 7%2.8 2%。1 6批不同产地厚朴叶单糖组成相似,主要是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖组成。主成分分析结果显示,湖北和重庆样品间的单糖组成得到明显区分。该试验所建立的方法操作简便,重复性和准确度高,适用于厚朴叶多糖中单糖成分的含量测定。关键词:厚朴叶;单糖;柱前衍生化;高效液相色谱法中图分类号:O 6 5 7.7+2 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6-6 1 4 4(2 0 2 3)0 3-3 7 2-0 5厚朴是为木兰科植物厚朴M a g n o l i a o f f i c i n a l i sR e h d.e tW i l s.或凹叶厚朴M a
5、 g n o l i a o f f i c i n a l i sR e-h d.e tW i l s.v a r.B i l o b aR e h d.e tW i l s.的干燥干皮、根皮及枝皮,神农本草经 将其列为上品,具有行气消积,燥湿除满,降逆平喘等功效,可用于治疗食积气滞、腹胀便秘、湿阻中焦等病症。在我国湘、浙、滇、粤、川、黔、渝、闽、鄂、甘、桂、皖、赣、苏、陕1 5个省份都有分布1。厚朴在传统上都是取皮入药,厚朴叶资源丰富,每年都能再生获得,但目前厚朴叶被遗弃或焚烧,导致了资源的浪费与环境的污染。植物多糖是由多个单糖通过糖苷键聚合而形成的生物活性大分子,具有广泛的药理作用,在免
6、疫调节、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等方面具有独特的功效2,3,多糖研究在医药学界逐渐成为研究的热点。厚朴叶的成分分析主要集中于酚类和黄酮类等成分4,5,鲜见厚朴叶多糖的相关报道。植物多糖的生物活性与其单糖组成密切相关6,7,而且单糖组成分析也是多糖质量控制的重要依据8-1 0。常用的单糖分离技术有毛细管电泳(C E)、气相色谱(G C)和高效液相色谱(H P L C)技术。其中,H P L C法稳定性好,色谱柱类型较多,技术相对成熟,但糖类化合物紫外吸收较弱,通常采用衍生化的方法使其形成具有较强紫外吸收的衍生物1 1。衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是一种酸性化合物,可与还原糖发
7、生醛基反应,产生强烈的紫外吸收。近年来,PMP-柱前衍生化-H P L C法由于其操作简单,方法灵敏,结果准确,被广泛应用于植物多糖中单糖组成分析。为此,本研究采用PMP-柱前衍生化-H P L C法对厚朴叶中D-果糖(F r u)、D-甘露糖(M a n)、鼠李糖(R h a)、D-葡萄糖(G l u)、D-阿拉伯糖(A r a)、273第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷D-木糖(X y l)等6种单糖含量进行测定,考察不同产地厚朴叶中这6种单糖的含量差异,旨在为厚朴叶资源的综合利用开发提供实验数据。1 实验部分1.1 仪器、试剂与材料W a t e r s e 2 6 9 5高效液相色
8、谱仪(美国沃特世公司);C a r y1 0 0C o n c紫外-可见分光光度计(美国瓦里安公司);S a r t o r i u sB T2 5S十万分之一分析天平(德国塞多利斯公司);T D 24-W S离心机(湖南湘仪仪器有限公司);HH-S 4数显恒温水浴锅电热恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂);M i l l i-Q超纯制备仪(美国M i l l i p o r e公司)。对照品D-葡萄糖(批号:1 1 0 8 3 3-2 0 1 9 0 8)、D-阿拉伯糖(批号:1 1 1 5 0 6-2 0 1 9 0 6)、D-木糖(批号:1 1 1 5 0 8-2 0 1 9 1 0),D
9、-果糖(批号:1 1 1 5 0 4-2 0 1 9 1 1)、D-甘露糖(批号:1 4 0 6 5 1-2 0 1 9 0 9)、鼠李糖(批号:1 1 1 6 8 3-2 0 1 9 1 2)均购于中国食品药品检定研究院,纯度均大于9 8%;甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)均购于赛默飞世尔科技有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(P M P),纯度为9 5%,购于上海麦克林生化科技有限公司;其他试剂为分析纯,均购于成都市科隆化学品有限公司;实验用水为M i l l i-Q超纯水。1 6批厚朴叶采自湖北(S 1S 8)、重庆(S 9S 1 6)经中国中医科学院中药研究所李化副研究员鉴定为木
10、兰科植物厚朴M a g n o l i ao f f i c i n a l i sR e h d.e tW i l s.或凹叶厚朴M a g n o l i ao f f i c i n a l i sR e h d.e tW i l s.v a r.B i l o b aR e h d.e tW i l s.的干燥叶。1.2 实验方法1.2.1 厚朴叶多糖的提取 厚朴叶自然晾干,粉碎过4 0目筛,备用。称取适量厚朴叶粉末5.0g,加4 0倍量超纯水,于7 0超声提取(功率3 0 0W,频率4 0k H z),8 0m i n后过滤,滤液以80 0 0 r/m i n离心1 0m i n,取
11、上清液于锥形瓶中,再加无水乙醇至总体积的8 0%,4静置过夜,以80 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃去上清液,用无水乙醇洗涤沉淀2次,水浴挥干无水乙醇。将沉淀加适量水复溶,加入等量的s e v a g e试剂(氯仿-正丁醇,体积比4 1)混合,充分振荡,以80 0 0r/m i n离心1 0m i n,取最上层液,减压浓缩干燥即得厚朴叶多糖。1.2.2 厚朴叶多糖的水解 称取“1.2.1”项所得厚朴叶多糖约1 0m g,精密称定,置具塞试管,精密加入1m L水溶解,制成浓度为1 0m g/m L的厚朴多糖溶液。吸取1 0 0L上述溶液于试管中,加入6 0 0L的2.5m o l/
12、LH2S O4,封口后于1 0 0水浴2h,取出,冷却,加入5m o l/L的N a OH溶液调节p H至7.0,即得厚朴叶多糖水解溶液。1.2.3 混合对照品溶液的制备与衍生化 精密称取D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖对照品适量,加超纯水溶解,配制成质量浓度分别为0.2 0 1m g/m L、0.1 5 8m g/m L、0.2 8 3m g/m L、0.5 8 2m g/m L、0.1 4 3m g/m L、0.0 1 8m g/m L的混合对照品储备溶液。分别精密吸取该混合对照品溶液1 0 0L、0.5m o l/L的PMP-甲醇溶液5 0L、0.3m o
13、 l/L的N a OH溶液5 0L,摇匀,于7 0水浴下反应3 0m i n,冷却,加入0.3m o l/L的盐酸5 0L调节p H至7.0,再加入氯仿1m L进行萃取,以80 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃去有机层,重复萃取3次,得上层溶液,过0.2 2m微孔滤膜,取续滤液,用于H P L C分析。1.2.4 厚朴叶多糖水解样品的衍生化 取“1.2.2”项下的水解液4 0 0L,加入0.5m o l/LPMP甲醇溶液4 0 0L与0.3m o l/LN a OH溶液4 0 0L,充分混匀,7 0水浴条件下反应6 0m i n,取出,冷却,加入0.3m o l/L盐酸4 0 0L
14、中和至p H=7.0,再加入氯仿1m L进行萃取,以80 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃去有机层,重复萃取3次,得上层溶液,过0.2 2m微孔滤膜,取续滤液,用于H P L C分析。1.2.5 单糖衍生物含量的H P L C方法 以P h e n o m e n e x(4.6mm 2 5 0mm,4m)为色谱柱,以0.2%磷酸溶液-乙腈(体积比8 2 1 8)为流动相,流速为1.0m L/m i n,检测波长为2 4 5n m,柱温为3 5,进样量为1 0L。2 结果与讨论2.1 提取条件优化首先比较了三氟乙酸在1 1 0油浴和浓硫酸在1 0 0水浴两种水解方法,发现浓硫酸水解
15、厚朴叶多糖效果更好,并且条件更简单,更容易实现,因此选择了浓硫酸水解多糖。考察了浓硫酸水解时间(1h、1.5h、2h、2.5h、3h),发现2h效果最好。PMP衍生化的条件直接影响厚朴叶单糖的含量测定,实验考察了P M P衍生化的温度(5 0、6 0、7 0、8 0、9 0)发现7 0效果较好,考察了衍生化时间(2 0m i n、373第3期黄国英等:柱前衍生化-H P L C法分析不同产地厚朴叶多糖的单糖组成第3 9卷3 0m i n、4 0m i n、5 0m i n)发现3 0m i n已衍生化完全。另外,p H也会对水解有影响,通过考察加入N a OH的量调节溶液p H,发现加入0.3
16、m o l/LN a OH溶液效果最佳。2.2 H P L C色谱条件优化比较了P h e n o m e n e x,O D S-3,K r o m a s i l 3种色谱柱的效果,发现P h e n o m e n e x色谱柱效果最佳。同时考察了有机相(甲醇、乙腈)和磷酸二氢钾的浓度(0.2%、0.5%、1%)、柱温(2 5、3 0、3 5、4 0)以及流动相比例对实验结果的影响。最终确定以0.2%磷酸溶液-乙腈(8 2 1 8)为流动相,流速为1.0m L/m i n,检测波长为2 4 5n m,柱温为3 5,进样量为1 0L。取衍生化后的厚朴叶多糖水解液和混合对照品溶液,分别按上述
17、色谱条件进样测定,色谱图见图1。图1(A)混合对照品溶液的衍生化样品的色谱图;(B)厚朴叶多糖水解液(S 8)的衍生化样品的色谱图F i g.1(A)L i q u i dc h r o m a t o g r a mo f r e f e r e n c e s u b s t a n c e;(B)L i q u i dc h r o m a t o g r a mo fM a g n o l i a o f f i c i n a l i ss a m p l e1.PMP;2.D-f r u c t o s e;3.D-m a n n o s e;4.R h a m n o s e;5
18、.D-g l u c o s e;6.D-a r a b i n o s e;7.D-x y l o s e.2.3 方法学考察2.3.1 标准曲线 精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、2.0、3.0、5.0m L,分别置于1 0m L容量瓶中,加超纯水定容至刻度,摇匀,作为系列对照品溶液进行测定。以6种单糖的质量浓度(X,g/m L)为横坐标、相应峰面积(Y)为纵坐标进行回归分析,结果见表1。由表1可知,D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖在各自检测质量浓度范围内的线性关系均良好(R2均大于0.9 9 9 4)。表1 单糖的线性关系考察T a b l e
19、1 L i n e a rr e l a t i o n s h i po fd i f f e r e n tm o n o s a c c h a r i d e sM o n o s a c c h a r i d eL i n e a re q u a t i o nC o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t(R2)L i n e a r r a n g e(g/m L)F r uY=52 9 2.1X-19 9 5.60.9 9 9 41 2.5 6-6 2 7.8 6M a nY=2 49 6 8.2X-22 2 9.00.9 9 9 94
20、.9 3-2 4 6.4 3R h aY=4 06 7 0.6X-2 25 9 9.31.0 0 0 01.7 8-1 7 7.1 4G l uY=4 72 8 2.3X-4 63 1 9.31.0 0 0 03.6 3-1 8 1.9 0A r aY=5 83 1 6.9X-43 0 1.21.0 0 0 00.9 0-4 4.8 2X y lY=5 44 9 7.3X-37 5 8.60.9 9 9 90.1 1-1 1.3 12.3.2 精密度、重复性及稳定性实验 取混合对照品溶液,优化实验条件下,连续进样6次,测定峰面积,D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖
21、的峰面积的R S D值分别为0.6 2%、0.1 6%、0.1 7%、0.1 4%、0.2 7%、0.7 3%,表明方法精密度良好。分别取同一批厚朴叶样品(S 8)6份,在优化实验条件下测定D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖的峰面积,计算6种单糖的R S D值分别为2.7 8%、2.5 5%、0.8 5%、0.8 9%、2.6 3%,表明该方法重复性较好。取厚朴叶样品(S 8)5.0g,按实验方法分别于0、2、4、8、1 2、1 6、2 0、2 4h进样,测定D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖的峰面积,6种多糖的R S D值分别为2.
22、1 6%、2.7 5%、0.8 5%、0.9 7%、1.0 3%、2.1 1%,表明厚朴叶样品溶液衍生化后在2 4h内比较稳定。2.3.3 加标回收率实验 取已知含量的厚朴叶样品(S 8)5.0g,共6份,精密称定,分别加入6种单糖对照品溶液适量(按样品中单糖含量的1 1比例加入),按实验方法,测定D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖的峰面积,计算回收率,6种单糖的平均回收率分别为1 0 0.2 2%、9 7.2 6%、9 9.5 0%、9 7.8 7%、9 7.1 7%、9 9.9 5%,其R S D值分别为2.0 2%、2.4 6%、2.4 3%、2.8 2%、
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