微柱凝胶结合抗球蛋白技术检测抗抗生素药物抗体方法建立的探讨.pdf
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1、微柱凝胶结合抗球蛋白技术检测抗抗生素药物抗体方法建立的探讨张媛,徐菲,包进,董林(南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院医学检验科,江苏 南京 )D O I:/b j m y i s s n 收稿日期:;修回日期:基金项目:江苏省输血协会英科新创科研基金(抗生素导致药物性溶血的实验室诊断)(编号:J s );江苏省医学重点学科建设单位(编号:J S DW )作者简介:张媛,女,主管技师,研究方向为医学检验和输血检验.E m a i l:q q c o m通讯作者:董林.E m a i l:q q c o m摘要:目的探讨建立采用微柱凝胶抗球蛋白检测筛选抗抗生素药物抗体的实验室方法.方法采用微
2、柱凝胶结合抗球蛋白法检测 例使用抗生素患者血浆和红细胞放散液中抗生素药物诱导抗体.结果血浆中共检出 例抗抗生素药物抗体,阳性率分别为头孢哌酮 、哌拉西林 、美罗培南 、头孢噻肟 、头孢曲松 ,美罗培南与其余种抗生素药物、头孢哌酮与哌拉西林及头孢噻肟、头孢曲松与头孢噻肟,阳性率之间差异有统计学意义(P ).红细胞D A T阳性率为 (例),D A T阳性和阴性的红细胞放散液中抗抗生素抗体阳性率分别为头孢哌酮 和 、哌拉西林 和 、头孢曲松 和 、头孢噻肟 和 ;前者在D A T阳性红细胞放散液中的抗生素药物抗体的阳性率明显高于后者(P ).结论无论直接抗球蛋白阳性与否,微柱凝胶结合抗球蛋白检测技
3、术适用临床对于使用抗菌药物患者的血浆或红细胞放散液中的药物性抗体的检测.关键词:抗生素;微柱凝胶法;药物包被红细胞;药物抗体;直接抗球蛋白实验中图分类号:R 文献标识码:AT h eD e v e l o p m e n t o faM i c r o c o l u m nG e lC o m b i n e dw i t hA n t i g l o b u l i nT e c h n i q u e f o r t h eD e t e c t i o no fA n t i a n t i b i o t i cD r u gA n t i b o d i e sZHANGY u a
4、 n,XUF e i,B AOJ i n,DONGL i n(D epa r t m e n to fL a b o r a t o ryM e d i c i n e,N a nji ngF i r s tH o spi t a l,N a nji ngM e d i c a lU n i v e r s i ty,N a nji ng ,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v eAl a b o r a t o rym e t h o df o rs c r e e n i nga n t i l a c t a ma n t i b o d i
5、 e sw a se s t a b l i s h e dbyu s i ngm i c r o c o l u m nge lc o m b i n e d w i t h a n t igl o b u l i n d e t e c t i o n t e c h n o l og y M e t h o d s A n t i b i o t i c d r ug i n d u c e da n t i b o d i e sw e r ed e t e c t e di npl a s m aa n dr e db l o o dc e l l sr e l e a s ef l
6、 u i do f pa t i e n t sbym i c r o c o l u m nge lb i n d i nga n t igl o b u l i na s s ayR e s u l t sT h e r ew e r e d r uga n t i b o d i e s i npl a s m a,t h epo s i t i v er a t e so fa n t i b o d i e sw e r ea sf o l l o w i ng:i nC e f ope r a z o n e,i nP ipe r a c i l l i n,i n M e r o
7、pe n e m,i nC e f o t a x i m e,a n d i n C e f t r i a x o n e,r e spe c t i v e ly T h e r e w e r es ign i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nt h epo s i t i v er a t e so fM e r ope n e ma n do t h e rf o u ra n t i b i o t i c s,C e f ope r a z o n ea n dP ipe r a c i l l i na n dC e
8、f o t a x i m e,C e f t r i a x o n ea n dC e f o t a x i m e(P )T h epo s i t i v er a t eo fD A Ti nr e db l o o dc e l l sw a s (c a s e s),a n d t h epo s i t i v er a t e so fa n t i a n t i b i o t i ca n t i b o dyi nD A Tpo s i t i v ea n dD A Tn ega t i v er e db l o o dc e l l r e l e a s
9、e sw e r e a n d o fC e f ope r a z o n e,a n d o fpipe r a c i l l i n,a n d o fc e f t r i a x o n e,a n d o fC e f t a x i m e,r e spe c t i v e ly T h epo s i t i v er a t eo fa n t i b i o t i ca n t i b o dyi nD A Tpo s i t i v e r e db l o o dc e l l r e l e a s ew a sh igh e r i nf i r s t t
10、 h r e e t h a n t h a t o f t h e l a s t(P )C o n c l u s i o nR ega r d l e s so fw h e t h e rD A Ti spo s i t i v eo r n o t,m i c r o c o l u m nge l c o njuga t e da n t igl o b u l i nd e t e c t i o n t e c h n iqu e s a r e s u i t a b l ec l i n i c a l lyt od e t e c t a n t i b i o t i
11、cph a r m a c o l ogi c a l a n t i b o d i e s i npl a s m ao rR B C s r e l e a s e f l u i d K e yw o r d s:A n t i b i o t i c;M i c r o c o l u m nge l i mm u n o a s s ay;D r ug c o a t e dR B C s;D r uga n t i b o dy;D A TL a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o 药物诱导
12、的免疫性溶血(d r u g i n d u c e di mm u n eh e m o l y t i c a n e m i a,D I I HA)是一种极为罕见溶血现象,每年发生率仅有一百万分之一,但是一旦发生,其导致的溶血会有较为严重并发症,如休克、弥漫性血管内 凝 血(d i s s e m i n a t e di n t r a v a s c u l a rc o a g u l a t i o n,D I C)、急性呼吸道疾病窘迫症(a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e,A R D S).在
13、疾病的治疗过程中,无论是不同的疾病,或者是疾病的不同阶段,都可能需要抗生素的运用,从而也导致了抗生素是所有药物中最容易导致D I I HA发生的药物 .有报道指出在 年 至 年,头 孢 替 坦 是 最 常 见 的 导 致D I I HA的药物;而到了 年至 年,哌拉西林成为最主要的抗生素.从病理上说,D I I HA是一种由型过敏反应导致红细胞破坏性疾病,是由包括抗生素在内的敏感源诱导I g G或I g M细胞毒性抗体介导 ,这种疾病多发生在长期使用敏感抗生素的患者中,因此检测这种抗体的存在也是预防该类患者发生D I I HA的关键.临床上,在医院的检验科或者输血科,为了输血安全的需要,通常检
14、测例如血型类抗体、自身免疫性抗体之类的免疫抗体的存在,然而因为检测手段的缺乏,药物诱导抗体并没有能引起重视.因此,我们根据微柱凝胶技术结合抗球蛋白可以准确地检测I g G和I g M抗体的原理,通过药物包被红细胞,探索建立一种相对简单易行的抗生素抗体检测方法.报道如下.材料和方法患者样本收集共 例患者,经过 d单一抗生素治疗,包括美罗培南、头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林钠舒巴坦钠、头孢噻肟钠舒巴坦钠、头孢曲松钠他唑巴坦钠.空腹采集E D T A K抗凝血 m L,g离心 m i n,分离血浆和红细胞放散液,保存待检.有如下情况的样本需排除:已经被诊断为溶血相关的疾病者,如遗传性球形红细胞增多症、
15、阵发性夜间血红蛋白尿、G P D缺乏症以及胆道疾病;药物过敏史者;入院前已经使用抗生素者;血浆或红细胞放散液中存在血型相关的不规则抗体者.试剂和仪器注射用美罗培南,深圳海滨药业有限公司生产;注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠,辉瑞公司生产;注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠,海口奇力药业有限公司生产;注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠和哌拉西林钠舒巴坦钠,中国湘北威尔曼药业有限公司生产.生理盐水,安徽双鹤药业有限责任公司生产.健康献血员O型全血,南京市红十字血液中心提供.不规则抗体筛检细胞、微柱凝胶抗球蛋白检测卡及其配套孵育器和离心机,长春博迅生物技术有限责任公司.方法 直 接 抗 球 蛋 白 实 验(d i r e c
16、 ta n t i g l o b u l i na s s a y,D A T)样本红细胞使用生理盐水稀释成 浓度,取 L加入抗球蛋白微柱凝胶卡中,g和 g分别离心 m i n和 m i n,肉眼观察结果,红细胞沉积在低部为阴性,混合在凝胶中或在凝胶上方为阳性.红细胞放散样本红细胞用生理盐水洗涤次,再加入等体积的生理盐水后,在 水浴中不停震荡 m i n,g离心 m i n,分离上清液为红细胞放散液.不规则抗体筛检 L血浆或红细胞放散液和等体积不规则抗体筛检细胞加入微柱凝胶抗球蛋白卡中,孵育 m i n,g和 g分别离心 m i n和 m i n,肉眼观察结果,红细胞沉积在低部为阴性,散在分
17、布在凝胶中或在聚集凝胶上方为阳性.药物包被红细胞 g抗生素、m Lp H B a r b i t u r a t eB u f f e r(B B)缓冲液、L健康献血员O型压积红细胞混合,室温孵育 h,每 m i n颠倒混匀次;随后 g离心 m i n,弃去上清液,下层压积红细胞即为抗生素药物包被红细胞,用 m LP B S缓冲液混匀保存,冰箱保存 d.实验前,使用生理盐水洗涤次,制备成浓度的红细胞悬液.抗生素药物抗体检测 L样本血浆或红细胞放散液与 L上述准备的药物包被红细胞,加入微柱凝胶抗球蛋白卡中,同时使用样本血浆或放散液与药物未包被红细胞、健康献血员的血浆或放散液与药物包被红细胞、健康
18、献血员的血浆或放散液与药物未包被红细胞,进行对照实验.美罗培南抗体检测需 孵育 m i n,其余种药物性抗体检测孵育时间为 h,随后 g和 g分别离心 m i n和 m i n.肉眼观察结果,红细胞沉积在低部为阴性,散在分布在凝胶中或在聚集凝胶上方为阳性.仅样本血浆或放散液与药物包被红细胞出现阳性,而其余组对照实验为阴性,为有效阳性结果;其余情况均为无效结果,需要重新检测.统计学处理所有数据为百分比表示,S P S S 卡方检标记免疫分析与临床 年月第 卷第期验或F i s h e r检验统计不同抗生素药物性抗体的阳性率,P 为差异有统计学意义.结果不规则抗体结果所有患者、健康献血员的血浆和红
19、细胞放散液均检测不规则抗体.排除阳性样本后,共有 例样本纳入本研究中.血浆中药物性抗体种抗生素使用者的血浆中均有相应的药物性抗体检出,共计 例,如表所示.其中美罗培南与其余种抗生素药物、头孢哌酮与哌拉西林及头孢噻肟、头孢曲松与头孢噻肟,阳性率之间差异有统计学意义(P).如表、表所示.表种不同抗生素形成药物性抗体的数量和阳性率药物总例数(例)药物性抗体检出数(例)抗体阳性率()头孢哌酮 哌拉西林 美罗培南 头孢噻肟 头孢曲松 表不同抗生素药物性抗体阳性率对比项目值P值头孢哌酮v s哌拉西林 头孢哌酮v s头孢噻肟 头孢曲松v s头孢噻肟 美罗培南v s头孢哌酮 美罗培南v s哌拉西林 美罗培南v
20、 s头孢噻肟 美罗培南v s头孢曲松 D A T检测红细胞D AT检测出阳性 例,除美罗培南使用者以外,其他种抗生素药物均有阳性检出,头孢哌酮 例,哌拉西林 例,头孢噻肟 例,头孢曲松例.其余均为阴性.如表所示.表D A T阳性和阴性的例数药物总例数(例)D A T阳性(例)D A T阴性(例)头孢哌酮 哌拉西林 头孢噻肟 头孢曲松 美罗培南 D A T阳性和阴性样本红细胞放散液中抗生素药物性抗体检测D A T阳性 例样本共计检测出 例抗生素药物抗体阳性,分别为头孢哌酮阳性率 (例)、哌拉西林 (例)、头孢噻肟 (例)、头孢曲松 (例).D AT阴性共计 例,检测 例抗生素药物抗体阳性,分别为
21、头孢哌酮阳性率 (例)、哌拉西林 (例)、头孢噻肟 (例)/头孢曲松 (例).D AT阳性和阴性红细胞放散液抗生素药物抗体阳性率对比头孢哌酮、哌拉西林、头孢曲松种药物性抗体的阳性率,D AT阳性明显高于D AT阴性(P).如表所示.表D A T阳性和阴性红细胞放散液抗生素药物抗体阳性率对比()药物阳性率(D A T阳性放散液)阳性率(D A T阴性放散液)值P值头孢哌酮 哌拉西林 头孢曲松 讨论临床上,抗生素的治疗会出现例如耐药、药物过敏等多种不同不良反应,其中也包括抗生素药物性抗体的形成造成的红细胞破坏现象,形成的该类抗生物药物抗体通常为I g G或I g M,而检验科或输血科对这两类的抗体
22、可以通过微柱凝胶结合抗球蛋白技术进行检测.本研究根据此思路,建立了微柱凝胶结合抗球蛋白法这种简单、快速、敏感的方法来检测抗生素药物性抗体的方法,该方法是将间接抗球蛋白技术和凝胶分子筛的作用相结合来检测I g G或I g M ,其原理是在凝胶的桥连作用下,I g G或I g M与红细胞表面抗原形成抗原抗体反应,通过离心作用,在红细胞聚集凝胶的上方或者散在分布在凝胶中的红细胞即为阳性,沉积在凝胶底部的为阴性.为了消除血型类不规则抗体对于实验的影响,我们先对患者的血浆、红细胞放散液进行不规则抗体检测,排除阳性样本,这样可以保证在后续的实验中出现阳性仅提示是药物性抗体存在.在本研究中,选取了种抗生素,
23、均为内酰胺类,包括种头孢菌素与酶抑制剂复合物(头孢哌酮钠舒巴坦钠、头孢噻肟钠舒巴坦钠、头孢曲松钠他唑巴坦钠)、一种碳青霉烯类抗生素(美罗培南)、一种L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o 青霉 素 与 酶 抑 制 剂 符 合(哌 拉 西 林 钠 舒 巴 坦钠),它们因其抗菌活性强、毒性低、品种多、抗菌谱广等优点,在临床治疗中被广泛运用.因为这些抗菌药物有着类似的结构,为了避免之间的交叉反应,纳入本研究的所有样本仅仅使用其中一种抗生素治疗.种复合制剂中有他唑巴坦和舒巴坦的存在,这两种是不可逆的内酰胺酶抑
24、制剂,它们和抗菌药物结合后,可以明显提高药物的抗菌活性.有研究指出舒巴坦只能通过非免疫蛋白吸附的机制导致D AT阳性和难以观察的缓慢血管外溶血的发生,并没有报道舒巴坦可以形成相应的药物依赖性抗体;在WU 等的研究报道中,也未出现他唑巴坦或舒巴坦的药物依赖性抗体的存在.因此,我们认为在本研究实验中出现的阳性现象是由于抗生素药物抗体存在引起的.报道指出二代或三代头孢菌素很容易因为相应药物抗体存在导致溶血的发生 ,WU等 的研究通过头孢哌酮包被红细胞检测出患者血浆中头孢哌酮抗体的存在.S A L AMA等 报道了一名免疫缺陷患者血管内溶血的发生是由于头孢噻肟抗体的存在;而在WU等 的另外一篇报道也指
25、出头孢噻肟钠舒巴坦钠 可 以 产 出 相 应 很 罕 见 的 头 孢 噻 肟 抗 体.L E I CHT等的报道中指出了使用头孢曲松治疗的患者血浆中也产生的相应头孢曲松抗体.相同的,在我们的实验中,血浆中均检测出头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟抗体的存在.在我们的研究中发现血浆中共有 例哌拉西林抗体的存在,这和L E GA R和L OH I YA等 的报道中哌拉西林使用患者检测出相应药物性抗体相符.在OKA等 的报道中,一位血管内溶血的患者,使用美罗培南包被的红细胞在其血浆中检测出了美罗培南抗体的存在,而我们的研究中也使用同样的方法也检测出两例阳性的结果.同时,在我们的研究中发现,美罗培南抗体检测
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