转录通读环状RNA_rt-...α表达和肾癌细胞增殖与侵袭_许云屹.pdf
《转录通读环状RNA_rt-...α表达和肾癌细胞增殖与侵袭_许云屹.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《转录通读环状RNA_rt-...α表达和肾癌细胞增殖与侵袭_许云屹.pdf(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、论著转录通读环状 NA rt-circ-HS 促进低氧诱导因子1表达和肾癌细胞增殖与侵袭许云屹1*,苏征征1,郑林茂1,张孟尼1,谭珺娅1,2,杨亚蓝1,张梦鑫1,徐苗1,陈铌1,2,陈雪芹1,2,周桥1,2(四川大学华西医院1 病理科,2 病理研究室,成都610041)摘要目的:鉴定肾癌细胞中由染色体 14q23 上相邻基因低氧诱导因子 1(hypoxia inducible factor 1,HIF1)和小核 NA 激活复合多肽(small nuclear NA activating complex polypeptide 1,SNAPC1)形成的转录通读 NA 及转录通读环状 NA(re
2、ad-through circular NA HIF1-SNAPC1,rt-circ-HS),研究 rt-circ-HS 在肾癌细胞及组织样本中的表达、对肾癌细胞生物学行为的影响以及对其亲本分子 HIF1 的调控机制。方法:逆转录 PC(reverse tran-scription-polymerase chain reaction,T-PC)和 Sanger 测序检测不同肿瘤细胞中由 HIF1-SNAPC1 形成的转录通读NA 和 rt-circ-HS 的表达。构建不同类型的肾细胞癌(renal cell carcinoma,CC)组织芯片共 437 例,用原位杂交检测 rt-circ-HS
3、 表达。采用小干扰 NA(small interference NA,si-NA)和人工过表达质粒干预 rt-circ-HS,用细胞计数实验(cell counting kit 8,CCK8)、EdU 掺入实验、Transwell 细胞迁移和细胞侵袭实验分别检测 rt-circ-HS 对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。用 T-PC 和 Western blot 验证干预 rt-circ-HS 对亲本分子 HIF1 和 SNAPC1 表达的影响。构建包含 rt-circ-HS、HIF1 3 端非翻译区(3 untranslated region,3 UT)与微小 NA 539(microNA 5
4、39,mi-539)结合序列的野生型和突变型质粒,用双荧光素酶报告基因系统检测 rt-circ-HS、HIF1 3 UT 与 mi-539的结合。结果:发现一个新的 rt-circ-HS,由 HIF1 外显子(exon)6-SNAPC1 exon 2 转录通读本产生,在肾癌细胞786-O 中高表达。Sanger 测序证实 rt-circ-HS 全长 1 144 nt,包括 HIF1 exon 2 exon 6 和 SNAPC1 exon 2 exon 4,是一个新的转录通读环状 NA。原位杂交结果显示,rt-circ-HS 在 CC 中阳性表达率为 67 5%(295/437),在不同类型 C
5、C 中表达率不同。发现 mi-539 是 HIF1 的转录后负调控分子;rt-circ-HS 作为分子海绵与 mi-539 结合,竞争性抑制 mi-539 与 HIF1 3 UT 的结合,解除其对 HIF1 的转录后负调控作用,促进亲本分子 HIF1 表达及肾癌细胞增殖、迁移和侵袭。结论:rt-circ-HS 作为分子海绵结合 mi-539,抑制其对 HIF1 的负调控作用,促进亲本分子 HIF1 表达及肾癌细胞增殖、迁移和侵袭。关键词转录通读环状 NA HIF1-SNAPC1;肾细胞癌;低氧诱导因子 1;小核 NA 激活复合多肽 1;微小 NA539 中图分类号365 文献标志码A 文章编号
6、1671-167X(2023)02-0217-11doi:10 19723/j issn 1671-167X 2023 02 004ead-through circular NA rt-circ-HS promotes hypoxia inducible factor 1 expres-sion and renal carcinoma cell proliferation,migration and invasivenessXU Yun-yi1*,SU Zheng-zheng1,ZHENG Lin-mao1,ZHANG Meng-ni1,TAN Jun-ya1,2,YANG Ya-lan1,Z
7、HANG Meng-xin1,XU Miao1,CHEN Ni1,2,CHEN Xue-qin1,2,ZHOU Qiao1,2(1 Department of Pathology,2 esearch Laboratory of Pathology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu610041,China)基金项目:国家自然科学基金(81872108、82273073、81872107、82273047)和四川大学专职博士后研发基金(2022SCU12022)Supported bythe National Natural Scienc
8、e Foundation of China(81872108,82273073,81872107,82273047)and the Post-Doctoral esearch and DevelopmentFunds of Sichuan University(2022SCU12022)Corresponding author s e-mail,zhou_qiao hotmail com*现在四川大学华西公共卫生学院卫生毒理与病理系网络出版时间:2023-2-1417:16:11网络出版地址:http:/kns cnki net/kcms/detail/114691 202302141015
9、002 htmlABSTACTObjective:To identify and characterize read-through NAs and read-through circular NAs(rt-circ-HS)derived from transcriptional read-through hypoxia inducible factor 1(HIF1)and smallnuclear NA activating complex polypeptide 1(SNAPC1)the two adjacent genes located on chromosome14q23,in r
10、enal carcinoma cells and renal carcinoma tissues,and to study the effects of rt-circ-HS onbiological behavior of renal carcinoma cells and on regulation of HIF1 Methods:everse transcription-polymerase chain reaction(T-PC)and Sanger sequencing were used to examine expression of read-through NAs HIF1-
11、SNAPC1 and rt-circ-HS in different tumor cells Tissue microarrays of 437 different712北京大学学报(医学版)JOUNAL OF PEKING UNIVESITY(HEALTH SCIENCES)Vol55No2Apr 2023types of renal cell carcinoma(CC)were constructed,and chromogenic in situ hybridization(ISH)wasused to investigate expression of rt-circ-HS in di
12、fferent CC types Small interference NA(siNA)andartificial overexpression plasmids were designed to examine the effects of rt-circ-HS on 786-O and A498renal carcinoma cell proliferation,migration and invasiveness by cell counting kit 8(CCK8),EdU incor-poration and Transwell cell migration and invasio
13、n assays T-PC and Western blot were used to exa-mine expression of HIF1 and SNAPC1 NA and proteins after interference of rt-circ-HS with siNA,respectively The binding of rt-circ-HS with microNA 539(mi-539),and mi-539 with HIF1 3untranslated region(3 UT),and the effects of these interactions were inv
14、estigated by dual luciferasereporter gene assays esults:We discovered a novel 1 144 nt rt-circ-HS,which was derived from read-through NA HIF1-SNAPC1 and consisted of HIF1 exon 2 6 and SNAPC1 exon 2 4 Expression ofrt-circ-HS was significantly upregulated in 786-O renal carcinoma cells ISH showed that
15、 the overall posi-tive expression rate of rt-circ-HS in CC tissue samples was 67 5%(295/437),and the expression wasdifferent in different types of CCs Mechanistically,rt-circ-HS promoted renal carcinoma cell prolifera-tion,migration and invasiveness by functioning as a competitive endogenous inhibit
16、or of mi-539,whichwe found to be a potent post-transcriptional suppressor of HIF1,thus promoting expression of HIF1Conclusion:The novel rt-circ-HS is highly expressed in different types of CCs and acts as a competitiveendogenous inhibitor of mi-539 to promote expression of its parental gene HIF1 and
17、 thus the prolifera-tion,migration and invasion of renal cancer cellsKEY WODSead-through circular NA HIF1-SNAPC1;enal cell carcinoma;Hypoxia induciblefactor 1;Small nuclear NA activating complex polypeptide 1;microNA 539环状 NA(cicurlar NA,circNA)由前体 NA反向剪接产生,不具有 5端帽子和 3 端多聚腺苷酸A 尾,其序列保守,稳定性高,在多种肿瘤发生发展
18、中发挥重要的调控作用1。例如,在肾细胞癌(renal cell carcinoma,CC)中,circNA cAPGEF5表达下调,促进肾癌细胞增殖、迁移和侵袭,与肿瘤大小、TNM 分期、远处转移及预后不良相关2。circNA ciS-7 则在肾癌细胞中高表达,作为 NA海绵影响 mi-139-3p 对 TAGLN 的转录后抑制作用,促进 TAGLN 表达,激活 PI3K/AKT 信号通路,促进肾癌细胞增殖、迁移和侵袭3。在 CC 中还有表达异 常 的 其 他 circNAs,包 括 表 达 增 高 的circPCNXL2、circ_000926 和表达降低的 circ_001895、circ
19、-AKT3 和 circATP2B14。转录通读 NA 由同一染色体上相邻基因顺式剪接产生,含有相邻基因的部分或全部序列5。多种肿瘤中存在不同的转录通读 NA,例如,在前列腺癌中转录通读 NA SLC45A3-ELK4 受雄激素调节而高表达,与 Gleason 评分和血清前列腺特异性抗原水平正相关5。在 CC 中,转录通读产生的嵌合 NA 占 所 有 嵌 合 NA 的 52 3%,其 中BC039389-GATM、KLK4-KSP1 和 CTSC-AB38 在肾癌中高表达,与患者不良预后相关6 7。生物信息学分析显示,低氧诱导因子(hypoxiainducible factor 1,HIF1)
20、与其下游基因小核 NA激活复合多肽(small nuclear NA activating complexpolypeptide 1,SNAPC1)可形成转录通读 NA。本课题研究肾癌细胞中 HIF1 和 SNAPC1 形成的转录通读 NA,探 索 其 形 成 的 转 录 通 读 环 状 NAHIF1-SNAPC1(read-through circular NA,rt-circ-HS)在肾癌中的表达、对肾癌细胞生物学行为的影响及作用机制。1材料与方法1 1材料1 1 1主要试剂细胞培养试剂洛斯维帕克纪念研 究 所 1640(oswell Park Memorial Institute1640
21、,PMI-1640)、高糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco s modified Eagle medium,DMEM)、Ham s F12(F12)、0 25%(体积分数)胰蛋白酶-乙二 胺 四 乙 酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)购自美国 Thermo Fisher 公司,胎牛血清(fetalcalf serum,FBS)购自以色列 Biological Industries 公司;NA 提取试剂 Trizol 购自大连 Takara 公司;逆转录 试 剂 HiScript Q T SuperMix for qPC(222)、2
22、apid Taq Master Mix 试剂(P222)、TaqPro Universal SYB qPC Master Mix 试剂(Q712)购自南 京 诺 维 赞 公 司。原 位 杂 交 试 剂 预 杂 交 液(A0152)、封闭液(A0150)、胃蛋白酶(A0151)购自武汉博士德公司。Western blot 试剂 IPA 蛋白裂解液(CW23333S)购自泰州康为世纪生物公司;一抗鼠抗人 HIF1(anti-HIF1,NB100-105)购自美国 Novus 公 司;兔 抗 人 SNAPC1(anti-SNAPC1,AP53957PU-N)购自美国 Origene 公司;鼠抗人-a
23、ctin(anti-actin,66009-1)和二抗购自武汉三鹰公司。1 1 2细胞人肾癌细胞(A498、ACHN、786-O、769-P)、人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)和人胚812北京大学学报(医学版)JOUNAL OF PEKING UNIVESITY(HEALTH SCIENCES)Vol55No 2Apr 2023肾细胞(HEK-293)购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC),人肾癌细胞(OS-C-2)购自中科院上海细胞库。1 1 3肾癌组织收集不同类型肾癌组织共 437例,均来自四川大学华西医院,包括透明细胞肾
24、细胞癌(clear cell CC,ccCC)177 例、乳头状肾细胞癌(papillary CC,pCC)70 例、嫌色肾细胞癌(chromo-phobe CC,chCC)82 例、TFE3 易位肾细胞癌(TFE3-CC)85 例以及 FH 缺陷性肾细胞癌(FH-CC)23 例,采用本课题组建立的方法制备组织芯片 8。1 2方法1 2 1细胞培养及转染细胞 A498、ACHN 和HEK-293 采用 DMEM+10%(体积分数)FBS 培养,细胞 786-O、769-P 和 OS-C-2 采用 PMI-1640+10%FBS 培养,细胞 HK-2 采用 F12+10%FBS 培养,待细胞密度
25、达 80%时胰酶消化,将细胞接种至 6孔板,过夜培养。将用于 rt-circ-HS 敲减的细胞分为空白组(blank)、对照组(si-NC,100 nmol/L)和 rt-circ-HS 敲减组(si-circ-HS,100 nmol/L);将用于转染过表达质粒的细胞分为空白组(blank)、pcDNA3 1空载质粒对照组(empty vector,1 g)和 rt-circ-HS过表达组(rt-circ-HS OE,1 g),使用 Lipofectamine3000(Invitrogen 公司,美国)脂质体转染。转染时采用无血清 PMI-1640 或 DMEM 培养基,转染后4 8h 换液。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 转录 通读 环状 RNA_rt 表达 肾癌 细胞 增殖 侵袭 许云屹
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。