无标记表面等离子共振免疫传感快速测定动物尿液中沙丁胺醇残留.pdf
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1、动物营养学报,():无标记表面等离子共振免疫传感快速测定动物尿液中沙丁胺醇残留肖志明 孙铭雪,姚 婷 李彦伸 黄 骅王 石 索德成 樊 霞(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,国家饲料质量检验检测中心(北京),北京;烟台大学生命科学学院,烟台;北京市兽药饲料监测中心,北京)摘 要:本研究旨在建立一种无需标记的直接竞争表面等离子共振()免疫传感器,以快速测定动物尿液中沙丁胺醇的残留。试验首先利用氨基偶联原理,将沙丁胺醇单克隆抗体固定到 传感器芯片表面,然后通过优化单抗固定浓度、和固定时间,以及芯片活化和封闭时间,进而得到最佳分析条件。结果表明:沙丁胺醇在 浓度范围内线性关系良好相关系数(
2、)为 ,最低检出限()可达 ,在添加浓度为、和 时,方法的平均回收率为,批内变异系数(相对标准偏差)为,批间变异系数为。将该 免疫传感器与超高效液相色谱串联质谱法()确证分析方法进行实际尿液样品测定比较,结果能够保持一致。本研究建立的直接竞争 免疫传感方法简便、快速、灵敏,且无需复杂的生物标记,适用于动物尿液中沙丁胺醇残留的日常检测分析。关键词:表面等离子共振;免疫传感器;动物尿液;沙丁胺醇中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:基金项目:“十三五”国家重点研发计划项目()作者简介:肖志明(),男,江西宁都人,副研究员,博士,研究方向为农产品质量与食物安全。:通信作者:樊 霞,研究员,
3、:沙丁胺醇()是一种人工合成的苯乙醇胺类 肾上腺素能受体激动剂,医学临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量,可治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病。沙丁胺醇与克伦特罗()、莱克多巴胺()等物质具有类似的化学结构(图),因其具有加速脂肪分解、促进蛋白质合成和提高饲料转化率等功效而被大量非法用于动物养殖,以提高瘦肉率,故常被俗称为“瘦肉精”。此外,沙丁胺醇对动物毛细血管具有显著扩张的作用,饲喂后动物在短时间内饮水量大增,以达到迅速“增重”的效果。由于此类违法饲喂往往是在养殖动物出栏时或屠宰前,药物不能经过充分代谢排出体外,导致动物组织中残留量高,因而比养殖环节饲喂更影响畜产品质量安全。美国和欧盟等多个国家
4、和地区已严令禁止将沙丁胺醇作为饲料添加剂在畜禽养殖中使用,我国也从 年前开始将包括沙丁胺醇在内的多种“瘦肉精”违法使用作为饲料和畜产品质量安全监测的重点,而高效的检测技术支持是打击沙丁胺醇违法使用的关键。近年来,检测动物组织、尿液、血液和饲料等各类生物样本中沙丁胺醇的方法不断发展和完善,包括液相色谱串联质谱法(,)、气相色谱质谱法(,)、酶联免疫吸附试动 物 营 养 学 报 卷验()法和电化学传感器分析法等。其中,和 灵敏度高、检测结果准确可靠,但对样品前处理要求较高,使用的仪器设备昂贵,耗时也较长;法基于免疫学分析原理,因其具有监测时间短、操作简便等优点,是目前应用最为广泛的筛查方法,但 法
5、需要使用酶或其他纳米材料标记,稳定性相对较差,容易出现“假阳性”甚至“假阴性”。图 克伦特罗()、莱克多巴胺()和沙丁胺醇()的化学结构式 (),()()表面等离子共振(,)是一种光学耦合的物理现象,其通过探测生物分子间相互作用引起的微小折射率变化,实现对生物效应中分子间相互作用的实时监测。使用 生物传感器进行直接法检测时,首先将一种高特异性的配体分子固定在传感器芯片上,再将含有能与配体结合的待测物溶液通入芯片表面,二者之间进行结合后使金属薄膜表面折射率发生变化,反映到仪器上即为响应值的改变,根据反应信号检测待测样品中所测物质的含量。生物传感器具有前处理简便、无需标记、样品用量少、灵敏度高以及
6、实时检测等优点,已广泛应用于医学诊断、食品安全、环境监测和生命科学等领域。然而,目前 技术主要应用于蛋白、核酸等生物大分子,在小分子识别方面的应用较少。因此,本研究采用直接竞争 技术,将沙丁胺醇单克隆抗体直接固定在 传感器芯片表面,利用抗原抗体特异性识别原理,以期建立动物尿液中沙丁胺醇残留的快速筛查新方法。材料与方法 试验材料与试剂 沙丁胺醇标准品和 缓冲液购自德国 公司;乙基(二甲氨基)碳二亚盐酸盐()、羟基琥珀酰亚胺()和甘氨酸盐酸()购自北京安众锐森科技有限公司;氢氧化钠()、乙酸钠、磷酸二氢钠()、磷酸氢二钠()和冰乙酸均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;沙丁胺醇单克隆抗体由北京
7、维德维康生物技术有限公司提供;试验用水为经 纯化制备的一级水(电阻率)。试验仪器与设备 试验用 仪购自美国 公司;型 计购自德国 公司;分析天平购自德国 公司;旋涡振荡器购自德国 公司;高速冷冻离心机购自德国 公司。试验方法 抗体固定条件选择 分别使用 种不同(、和)的 乙酸钠缓冲液,并配制不同浓度(、和 )的 沙 丁 胺 醇 抗 体 溶 液,依 次 以 的 速 度 通 入 仪 器 中,并 使 用 溶液对 传感器芯片表面进行洗脱,根据响应值选择最适的乙酸钠缓冲液 和抗体浓度。抗体固定过程 首先,将 和 按(体积比)的比例混合,以 的流速激活 传感器芯片表面,再用 中确定好的乙酸钠缓冲液稀释沙丁
8、胺醇单克隆抗体至适宜浓度,以 的流速固定在新激活的芯片表面上,最后选用 乙醇胺溶液灭活芯片未反应位点,封闭芯片表面。再生条件确定分 别 考 察 和 (分别为、和)作为再生液时的响应值,判定再生效果,每个再生液单次注射时间设定为 ,重复注射 次。期肖志明等:无标记表面等离子共振免疫传感快速测定动物尿液中沙丁胺醇残留 标准曲线建立 传感器灵敏度高,因而无需对动物尿液样品进行复杂的前处理,只需进行简单的离心处理即可(在 条件下离心 )。选择经超高效液相色谱串联质谱法()确证的空白尿液样品,添加沙丁胺醇标准溶液,使得沙丁胺醇的浓度分别为、和 ,配制基质添加标准曲线,上 仪进行测定。测定时的进样流速为
9、,抗原抗体结合时间为 ,解离时间为 ,每次进样完成后,使用 中确定的再生液进行洗脱,再生时间为 。特异性试验 将 缓冲液(作为阴性对照)和相同质量浓度()的沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺标准溶液依次通入到 传感器芯片表面,每种溶液重复测定 次,以验证该方法对沙丁胺醇的特异性。稳定性和重复性试验 将 沙丁胺醇标准溶液通入到 仪中,连续 ,每天进行 次重复试验,用响应值的变化来评估芯片的稳定性和重复性。由于 仪对于温度变化较为敏感,此过程需保持 仪处于()环境中运行。加标回收试验 在优化试验条件下,在空白猪、牛和羊尿液中分别加入沙丁胺醇标准溶液,使添加浓度分别为、和 ,每天每个添加浓度进行 次平行
10、试验,连续试验 ,测得响应值,通过标准曲线计算实际测得浓度。实测浓度与添加浓度的比值为回收率,每天平行试验结果的相对标准偏差()为批内变异系数(),重复试验结果的 为批间变异系数()。实际样品测定 通过从全国范围内的不同养殖场采集一定数量的猪、牛和羊尿液实际样品,经 确证分析后,对本研究中建立的无标记 方法进行验证,分析 直接检测方法的有效性和准确性。结果与分析 抗体固定条件 乙酸钠缓冲液 和抗体浓度选择 分别用 为、和 的乙酸钠缓冲液将沙丁胺醇抗体稀释至 个不同浓度(、和 ),再将溶液注射入 传感器芯片表面,比较响应值的变化,结果分别如图、图 和图 所示。通过比较图、图 和图 可以看出,当乙
11、酸钠缓冲液 为、沙丁胺醇抗体稀释浓度为 时,响应值最高(),抗体富集效果最好(图),因此选择为最优偶联条件。图 下、和 乙酸钠溶液预富集结果 ,图 下、和 乙酸钠溶液预富集结果 ,抗体固定条件优化结果 经 分析,选用 、为 的乙酸钠缓冲液将沙丁胺醇抗体稀释至 ,作为抗体固定条件。首先将 和 混合液活化芯片和乙醇胺封闭芯片的时间分别设定为、和 ,并设定抗体固定时间为 ,获得响应值分别为()、()和()(),抗体固定动 物 营 养 学 报 卷过程如图 所示。结果表明,随着时间的延长,对芯片表面的活化程度有所增加,使得芯片对抗体的固定量增加,响应值相应提高;然而,后响应值提升并不明显,表明抗体的固定
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