外源IAA作用下草地早熟禾中调控Cd长距离运输的关键基因表达及其代谢通路分析.pdf
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1、为探究吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)对草地早熟禾中镉(cadmium,Cd)从根系到叶片长距离运输的影响及相关机制,分析 IAA 作用下草地早熟禾响应 Cd胁迫的差异基因及代谢通路。以草地早熟禾为试验材料,在水培条件下,叶面喷施 400 nmol L-1外源 IAA 并施加 600 mol L-1 Cd胁迫。进行株高、根长、根系和叶片 Cd含量测定及转录组测序。利用实时荧光定量验证转录组数据准确性。结果表明,外源施加 IAA 可促进 Cd胁迫下草地早熟禾株高和根长,抑制 Cd从根系向叶片的长距离运输。转录组分析发现,Cd胁迫下共有 1294条基因被 IAA 显著调
2、控。实时荧光定量结果与 RNA-Seq表达模式一致。GO 富集分析表明,IAA 可调控响应高温、低温、Cd离子及病毒的相关基因抵御 Cd 胁迫,其中分子伴侣蛋白 HSP70、激酶 MAPK 和转录因子 MYB46 被明显上调。另外,外源IAA可上调谷胱甘肽代谢及木质素合成通路上的基因,可能增加谷胱甘肽合成及细胞壁木质化,进一步增加液泡区隔化和降低 Cd进入细胞,从而减少叶片 Cd含量。本研究可为 IAA信号作用下 Cd转运与分配机制研究提供参考。关键词:Cd胁迫;草地早熟禾;生长素;转录组;Cd转运Analysis of the key exogenous IAA-induced gene e
3、xpression levels and metabolic pathways involved in long-distance translocation of Cd in Poa pratensisCUI Ting,WANG Yong,MA Hui-ling*College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education,Pratacultural Engineering Laboratory of Gans
4、u Province,Sino-U.S.Center for Grazing Land Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,ChinaAbstract:This research aimed to investigate the effects and molecular mechanisms of indole-3-acetic acid(IAA)-induced decrease of the long-distance translocation of cadmium(Cd)from the roots to the shoots in Ken
5、tucky bluegrass by analysis the differentially expressed IAA-induced genes(DEGs)and metabolic pathways involved in response to Cd stress.The species Poa pratensis was used as the study material and 400 nmol L-1 IAA was sprayed on the leaves of plants subjected to 600 mol L-1 of Cd stress.Plant heigh
6、ts,root lengths,and Cd concentrations in the roots and leaves were measured,and transcriptome sequencing was performed in both the Cd+IAA and Cd treatments.Real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)was used to verify the accuracy of the RNA-seq.It was found that exogenous IAA signific
7、antly increased the plant heights and root lengths,and inhibited the long-distance translocation of Cd from roots to leaves.There were 1294 genes with significantly IAA-modified DOI:10.11686/cyxb2022276http:/收稿日期:2022-06-28;改回日期:2022-09-28基金项目:国家自然科学基金项目(32071886)资助。作者简介:崔婷(1996-),女,甘肃会宁人,在读硕士。E-mai
8、l: 通信作者 Corresponding author.E-mail:第 32 卷第 6 期草业学报 2023 年expression under Cd stress in Kentucky bluegrass.The expression levels of RT-qPCR had a high correlation with RNA-seq data.Gene ontology(GO)enrichment analysis showed that the genes involved in response to heat,cold,Cd,and virus exposure were
9、 induced by IAA.The molecular chaperone HSP70,protein kinase mitogen-activated protein kinase(MAPK),and transcription factor myeloblastosis46(MYB46)were very obviously up-regulated by IAA application.In addition,genes involved in the glutathione metabolism and lignin biosynthesis pathways were also
10、up-regulated by exogenous IAA.This may be indicative of increased glutathione synthesis and lignification of the cell wall and further increase the vacuolar compartmentalization and decreased the Cd entry into cells,and further decrease the Cd concentration in leaves.This study provides reference da
11、ta on mechanisms of IAA-induced translocation and distribution of Cd.Key words:Cd stress;Kentucky bluegrass(Poa pratensis);auxin;transcriptome;translocation of Cd工业发展和人类活动带来的土壤重金属污染对生态环境及人类健康造成了严重威胁1。镉(cadmium,Cd)是重要的土壤重金属污染物之一。土壤中的 Cd被植物吸收后在植物体内累积可造成植物生长抑制、萎蔫、失绿等毒害症状,严重时可导致植物死亡2。另外,植物中的 Cd可通过食物链富集,
12、进一步危害动物健康3。Li等4对我国 72个矿区调查研究发现,部分矿区环境土壤 Cd含量为背景值的 36.5倍。郭展翅等5在长江中下游地区农田中也检测到 Cd含量超标土壤。因此,开展 Cd污染土壤治理研究对粮食安全及生态环境均具有重要意义。众多研究表明,生长素信号参与响应植物重金属胁迫。陈晶6研究表明,施加外源生长素可缓解玉米(Zea mays)Cd 胁迫,降低 Cd 从根系向叶片的运输。生长素在调节植物生长发育中的作用与活性氧(reactive oxygen species,ROS)密切相关,生长素诱导产生的 ROS可直接引起细胞壁松弛,在细胞伸长中起重要作用7。少量的ROS可促进生长素信号
13、介导的侧根形成,而过量的 ROS则导致生长素信号通路上的基因下调表达,抑制生长素的极性运输8。一般认为,Cd胁迫导致植物生长素氧化酶活性和细胞壁木质化的增加从而导致生长抑制9。根系细胞壁是植物防御 Cd胁迫的第一道屏障,细胞壁中的果胶、多糖及某些特定的蛋白质等物质可作为 Cd结合交换位点,以阻止 Cd进入原生质体,减轻 Cd毒害2。另外,谷胱甘肽是植物体内重要的 Cd解毒物质,可以与 Cd螯合形成低毒的复合体并存储在液泡中,减少 Cd从根部向地上器官的运输10。谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)是植物体内合成谷胱甘肽的关键酶,Cd 胁迫下施加外源生
14、长素可显著增加植物 GST 活性,从而缓解 Cd胁迫11。这些研究表明,生长素信号在植物抵御 Cd胁迫中具有关键作用,但是生长素调控的 Cd解毒及转运在分子层面的机制尚不明确。超富集植物可有效吸收土壤中的 Cd,从根本上缓解土壤 Cd污染12。近年来,一些超富集植物例如东南景天(Sedum alfredii)12、龙葵(Solanum nigrum)13、鬼针草(Bidens pilosa)14等相继被发现。然而,这些超富集植物由于生长缓慢、生物量小、耐受能力差等因素,在植物修复方面具有一定的局限性。徐佩贤15研究发现草地早熟禾(Poa pratensis)相比于超富集植物龙葵而言,具有更高的
15、 Cd耐受性及富集能力,且草地早熟禾具有生物量大、生长快速、根系致密、抗逆性强等优点,在 Cd污染土壤修复方面具有明显优势。探究草地早熟禾对 Cd的吸收及转运机制对其在 Cd污染土壤修复中的应用具有重要意义。本课题组前期研究发现生长素信号参与响应草地早熟禾 Cd胁迫16,然而,生长素信号如何调控草地早熟禾抵御 Cd毒害以及生长素如何影响草地早熟禾体内 Cd转运的机制尚不明确。1材料与方法1.1试验材料与幼苗培养以草地早熟禾品种“午夜(Midnight,M)”为试验材料(购自北京克劳沃生态科技有限公司),于 2022 年 3月,在甘肃农业大学人工气候室,将 1 g 其种子均匀撒播在填装了蛭石的花
16、盆(20 cm15 cm13 cm,长宽高)中,并覆盖约 1 cm 厚度的蛭石。每天喷洒蒸馏水保持湿润的萌发条件。幼苗生长至 1 cm 左右时浇灌霍格兰德营147Vol.32,No.6ACTA PRATACULTURAE SINICA(2023)养液,营养液培养 14 d后将长势一致的草地早熟禾移栽至水培盒(12 cm8 cm11 cm,长宽高),每盒移栽18株草地早熟禾。继续用霍格兰德营养液培养 30 d后施加处理。1.2外源生长素及 Cd胁迫处理生长素处理叶面喷施 400 nmol L-1吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA),Cd 胁迫处理添加 600 mol L-
17、1 CdCl22.5H2O 将上述预培养的幼苗分为 4 组,每组 3 个重复。对照组(CK)与 Cd 处理(Cd)组叶面喷施蒸馏水,Cd胁迫+外源生长素(Cd+IAA)处理组与仅生长素(IAA)处理组均叶片喷施 400 nmol L-1的 IAA 处理液。每个水培盒中的草地早熟禾叶面喷施 20 mL 处理液。Cd和 Cd+IAA 处理组在根部营养液中施加 600 mol L-1的Cd胁迫处理。施加 IAA 处理 3 d后,施加 Cd胁迫处理。Cd处理 24 h后进行转录组测序,每个处理 3次重复。Cd处理 5 d后测定株高和根长,每个处理 20次重复。14 d后测定根系和叶片 Cd含量,每个处
18、理 3次重复。1.3Cd含量测定将草地早熟禾组织在 105 杀青 15 min后,75 烘干至恒重。用粉碎机(三利 DFT-100,深圳)粉碎后取 0.1 g样品,加入 7 mL硝酸和 1 mL过氧化氢,放入微波消解仪(TOP wave,耶拿,德国)消解后定容至 50 mL。用火焰原子吸收分光光度计(AA-6800,岛津,日本)测定 Cd浓度。1.4总 RNA提取及转录组测序鉴于植物根系在 Cd吸收中的关键作用,本试验以根系为研究对象,具体方法如下:0.2 g草地早熟禾根系液氮研磨后用 Trizol reagent(Invitrogen,CA,美国)提取总 RNA,并使用 RNA 1000 N
19、ano LabChip Kit(Agilent,CA,美 国)纯 化 RNA。用 信 使 RNA 测 序 样 品 准 备 试 剂 盒 mRNASeq sample preparation kit(Illumina,San Diego,美国)进行反转录,构建 cDNA文库,在 Illumina Novaseq 6000(LC Sceiences,美国)平台完成测序。1.5转录组从头组装、注释及功能分类上 述 序 列 用 Cutadapt 去 除 低 质 量 和 未 检 测 到 的 碱 基 后17,在 FastQC(http:/www.bioinformatics.babraham.ac.uk/p
20、rojects/fastqc/)平台检验数据质量。所有后续分析均基于高质量的清洁数据。使用 Trinity 2.4.0 从头组装转录组序列18。组装后的数据被注释到非冗余蛋白质数据库(nonedundant protein database,Nr)19,基因本体论数据库(gene ontology,GO)20,蛋白序列数据库(SwissProt)21,京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)22及 eggNOG 数据库23。用 Salmon 软件计算基因表达水平,并以|log2(fold change)|1和 P-va
21、lue0.05为阈值筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。所有 转 录 组 测 序 原 始 数 据 已 上 传 至 NCBI 公 共 数 据 库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/),数 据 编 号 为PRJNA863677。1.6实时荧光定量(RT-qPCR)验证随机选取 15 条基因进行转录组数据验证(表 1)。利用 Primer-BLAST(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)在线工具进行设计引物,总 RNA 提取用 RNAprep p
22、ure Plant Kit(Tiangen,中国),用反转录试剂盒 PrimeScript RT Reagent Kit(TaKaRa,Otsu,日本)构建 cDNA 文库。在实时荧光定量 PCR 仪LightCycle 96(Roche,Rotkreuz,瑞士)中进行 RT-qPCR 分析,反应体系为 20 L,包括 10 L SuperReal PreMix Plus SYBR Green(Tiangen,中国),上下游引物各 0.6 L,5 L cDNA 和 3.8 L ddH2O。以 PpACT 为内参基因,扩增条件和计算方法均参照 Niu等24的方法。1.7数据统计采用 Excel
23、2019进行组间显著性分析和绘制柱状图,数据用“平均值标准误”表示,株高和根长组间对比采用单因素方差分析,Cd含量数据组间对比采用 T检验。2结果与分析2.1外源 IAA对 Cd胁迫下草地早熟禾生长及 Cd含量的影响图 1A,B 显示,Cd 胁迫显著抑制草地早熟禾株高和根长,施加外源 IAA 可显著增加其株高和根长(P0.05)。因此,施加 400 nmol L-1外源 IAA 可促进草地早熟禾生长,缓解 Cd 胁迫的抑制作用。施加外源 IAA 可148第 32 卷第 6 期草业学报 2023 年显著降低草地早熟禾叶片 Cd含量,增加根系 Cd含量(图 1C)。表明外源 IAA 施加可抑制 C
24、d从根系到叶片的长距离运输。2.2转录组质量控制与结果统计高质量的序列数据获取是转录组后期分析执行的必要条件。根据表 2 可知,从 12 个 cDNA 文库中共获得3.961075.50107条原始序列,删除低质量数据后得到 3.871075.38107条高质量的清洁序列。每个样本 Q20的占比均高于 98%,且 Q30的占比均高于 94%。GC 含量控制在 52%左右。因此,转录组测序质量可靠,可用于后续分析。Cd 胁迫下,与 CK 相比,共有 57647 条差异基因被显著调控,参与响应 Cd 胁迫(图 2)。Cd 胁迫下施加外源IAA 后,与仅 Cd胁迫处理相比,共有 1294条基因被显著
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