泗洪地区克氏原螯虾病原维氏气单胞菌鉴定及致病性分析.pdf
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1、为了探究江苏省泗洪县多家养殖场克氏原螯虾(Procambarus clarki)出现暴发性死亡的病因,本研究以濒死的克氏原螯虾进行病原检测分析,从濒死虾肝胰腺中分离到优势生长菌(菌株编号CPA2020),经对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及gyrB基因同源性与系统发育分析,结果表明引起克氏原螯虾暴发性死亡的病原为维氏气单胞菌(Aeromonasveroni),人工感染实验结果表明分离菌CPA2020对克氏原螯虾具有较强的致病性,LDso为6.3110 CFU/mL。组织病理学观察发现克氏原螯虾的肝胰腺与肠道组织出现严重的病理损伤,肝细胞裂解,空泡化严重,部分肝细胞坏死,肠壁结缔组织萎缩,
2、皱减少,肠上皮细胞坏死,与自然患病虾的病理变化相同。毒力基因检测表明分离菌CPA2020携带lip、h l y、l g N、o mp A、l g M、l a H、a h a 和lgA8种毒力基因。此外分离菌CPA2020可分泌卵磷脂酶、明胶酶和溶血素。耐药谱测定结果显示,该菌对链霉素、万古霉素、环丙沙星等12 种药物耐药,对头孢唑林、克拉霉素等9 种药物中介,对头孢呋辛、左氟沙星、氨曲南等13种药物敏感。关键词:维氏气单胞菌(Aeromonas veronii);克氏原螯虾(Procambarus clarki);致病性;耐药性中图分类号:S945.4文献标识码:A文章编号:10 0 0-6
3、9 0 7-(2 0 2 3)0 4-0 0 6 1-11克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称小龙虾,隶属甲壳纲十足目螯虾科,具有食性杂、养殖周期短、环境适应能力强等特点,具有较高的经济价值,是我国常见的水产养殖品种之一1。自1929年从日本引人国内后,克氏原螯虾养殖产业进人快速发展期,已成为一些地区的支柱性产业及重要经济来源2 。同时,随着养殖规模的不断扩大及水环境的急剧恶化,小龙虾病害问题日趋频繁和严重。近年来,细菌性病害已成为克氏原螯虾产业发展的主要制约因素,且病原细菌呈现种类多、致病性强、发病率高和耐药性增强等特点。目前已有报道可引起克氏原鳌虾暴发性死亡的病原菌主
4、要包括豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)3、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)4、维氏气单胞菌(A.vero-ni)5、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundi)6 等,病虾表现为食欲减退、行动迟缓、活力减弱,鳃部附着大量污物等。气单胞菌属是我国淡水养殖业常见的致病源之一,易引起多种水生养殖动物的大规模死亡7 。维氏气单胞菌隶属于气单胞菌科气单胞菌属,是一种广泛存在于淡水、海水、淤泥和土壤中的条件致病菌,感染鱼类后主要引发细菌性败血症,以引起皮肤溃烂及坏死为典型症状8 。已有报道该菌可导致草鱼(Ctenopharyngodon idella)9、鲫(Caras
5、-sius auratus)10 、尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotic-us)、黄颖鱼(Pelteobagrus fulvidraco)12 、黄鳝(M o n o p t e r u s a l b u s)13、锦鲤(P.fulvidraco)14、大口黑鲈(Micropterus salmoides)15】、斑点叉尾(lc-talurus punctatus)【16 等鱼类发病死亡。此外,维氏气单胞菌也会引起中华绒螯蟹(Eriocheir sinen-sis)17 、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)【18 、青虾(Macrobrachium mipp
6、onensis)19 等甲壳类水生养殖动物大量死亡。周慧华等2 0 在2 0 17 年6 月从患病中华绒螯蟹中分离出致病性维氏气单胞菌;姜光明等2 1 报道,2 0 16 年也从江苏某地患菌血症的克氏原螯虾上分离到强致病性的维氏气单胞菌;胡骞等2 2 报道维氏气单胞菌感染克氏原螯虾后可导致其反应迟钝,引起肝胰腺等组织损伤,且死亡数量收稿日期:2 0 2 2-0 8-18;修订日期:2 0 2 2-12-2 8资助项目:江苏省政策引导类“富民强县”项目(SZ-SQ20210567,SZ-SQ 2 0 2 10 55)第一作者简介:汤环宇(1995),男,硕士研究生,专业方向为水产动物病害及病原微
7、生物学。E-mail:2 8 2 3590 0 6 q q.c o m通讯作者:张晓君。E-mail:z x j 930 7 16 3.c o m62大。5-7 月是克氏原螯虾养殖与出售的关键时期,而此时水温与维氏气单胞菌的最适温度区间相重合,正是维氏气单胞菌繁殖最为旺盛的时候,这使得维氏气单胞菌对克氏原螯虾养殖业的危害更甚于其他水产品。已有研究表明,维氏气单胞菌致病性受到其毒力因子分泌、表达的控制,如外毒素、肠毒素、胞外蛋白酶和各种黏附因子等2 3。其中溶血素、胞外蛋白酶是维氏气单胞菌的重要毒力因子,在病原菌的致病过程中起到决定性的作用。罗志飞等2 4曾通过研究发现气单胞菌弱毒株培养上清均不
8、溶血、不溶蛋白,而强毒株具有强溶血活性和溶蛋白活性。维氏气单胞菌致病机制较为复杂,可能是由多个毒力因子共同作用所致。因此,检测分离菌所携带毒力因子,对揭示其潜在致病性至关重要。溶血素是维氏气单胞菌的重要毒力因子,它通过改变细胞膜的通透性,进而使红细胞破裂溶解来表现出溶血性和肠毒性,而且溶血素还会破坏其他细胞,且这种破坏是不可逆转的2 5。目前,关于维氏气单胞菌溶血素的研究较少,SREEDHARAN等2 6 从濒死的鱼类分离出的维氏气单胞菌均含有aerA和hlyA基因,研究表明这些基因能对宿主细胞的损伤和死亡造成一定影响,而本次实验中也在分离菌CPA2020中发现了hly基因,证明这也是克氏原鳌
9、虾致病过程中维氏气单胞菌毒力的重要来源之一。此外,各种胞外酶活性也是气单胞菌毒力的重要因素2 7 。胞外蛋白酶是一类广泛存在的酶,在细菌致病性、应激反应和细胞活力等方面发挥着重要作用。明胶酶是一种潜在的毒性因子,它缺乏明显的底物特异性,可水解酪蛋白、血红蛋白、胶原蛋白等多肽,造成广泛的组织损伤,并有助于细菌在高密度环境中的传播。同时,毒力基因检测从致病菌CPA2020中还发现脂肪酶基因lip,NA W A Z 等2 8 在对鲶鱼毒力因子的研究中发现,脂肪酶会破坏红细胞的细胞膜,致使细胞发生溶解。外膜蛋白(out-er membrane proteins,Omps)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构,
10、与维持细胞形态、物质代谢、组织黏附及致病等密切相关2 9。王薇等30 的研究证实了OmpA 是拟态弧菌的一种重要黏附素,它通过黏附参与致病作用,是一种重要的毒力因子。Namba等31 报道,从鲤肠道中分离出来的维氏气单胞菌CWP11菌株产生的外膜蛋白OMPA是一种黏附因子,经克隆和核苷酸测序发现OmpA存在2 个串联淡水渔业的 OmpA I-Omp A 同系物,利用同源重组技术缺失该菌株的OmpAI,发现可降低对鲤鱼肠上皮细胞的黏附活性降低,说明OmpAI对肠上皮细胞有较强的黏附作用。近年来江苏省泗洪多家克氏原鳌虾养殖场细菌性病害颇为严重,病虾往往呈现虾体发红、四肢无力、摄食减少、行动迟缓、对
11、外界刺激反应迟钝、肝胰腺水肿等症状,并陆续出现暴发性死亡。为明确该病病原,本研究对江苏省泗洪螯虾主养区的多个典型发病养殖场进行调研与病原检测。通过对分离菌进行致病性、形态特征观察、理化特性鉴定,结合gyrB基因序列测定与系统发育学分析,结果表明引起克氏原螯虾暴发性死亡的病原为维氏气单胞菌。研究结果可为克氏原螯虾细菌性病害的防治及维氏气单胞菌致病机理的深人研究提供参考。1材料与方法1.1实验虾发病克氏原螯虾平均体长(7.0 1.0)cm取自江苏省泗洪县某克氏原螯虾养殖场,症状为摄食减少、反应迟缓、腹部肌肉肿胀,肝胰腺水肿,颜色加深。用于回归感染实验的健康克氏原螯虾取自江苏省扬州市克氏原螯虾养殖场
12、,本实验采用了封闭循环水养殖系统,养殖用水经曝气2 d,水温(2 42 5),每日投喂人工饲料1次。1.2病原菌的分离与纯化取患病克氏原螯虾肝胰腺划线接种于LB培养基平板,于2 8 过夜培养。挑取优势单菌落划线接种于LB培养基上,进一步纯化,2 8 培养18h,选取单菌落(菌株编号为CPA2020)接种于LB液体培养基培养,置于甘油管40 保存备用。1.3病原菌人工感染实验将纯化的优势菌(CPA2020)接种于LB培养基并于2 8 过夜培养18 h,用无菌生理盐水调至浓度为1.6 10 4、1.6 10 5、1.6 10、1.6 10 7和1.6 10 CFU/mL。选用暂养5d的健康克氏原螯
13、虾,每个实验组分别注射感染2 0 只健康克氏原螯虾,每只虾注射0.1mL不同浓度的菌液,同时设立无菌生理盐水作对照,对照组虾注射等量无菌生理盐水。连续观察虾的死亡情况并记录,按Be-hreans and Karber 方法32 计算半数致死剂量 LDso,对濒死虾进行细菌再分离和鉴定。1.4病原菌的鉴定对分离菌CPA2020分别进行革兰氏染色、氧2023年第4期化酶、接触酶、糖(醇及苷)类代谢、硝酸盐还原、O-F实验、动力等理化特性测定,各项理化指标的测定主要参照Bergeys Manual of SystematicBacteriology3 进行。细菌微量生化反应管等均购自杭州天和微生物试
14、剂有限公司。1.58gyrB基因序列测定与系统发育学构建1.5.1PCR模板DNA的制备取纯培养菌分别接种于含盐1%的营养LB肉汤中2 8 培养16 h,按 TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(上海赛百盛基因技术有限公司产)使用说明书提取DNA作为PCR模板DNA,20 保存待用。1.5.2gyrB基因序列的PCR扩增与测序gyrB基因PCR扩增的两个引物分别为:UP1(正向引物):5-GAAGTCATCATGACCG TTCTG-CAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3,U P2 r(反向引物):5-AGCAGGGTACGGATGT GCGAGCCRTCNA-CRTCNGCRTCN
15、GTCAT-3。在2 0 L反应体系中含有:正反引物各0.5L,PCR M i x 10 L,d d H,08L,细菌基因组模板1L。PC R反应条件为:94预变性4min;94变性1min,55退火1min,7 2 延伸2 min,共30 个循环;7 2 延伸6min;16 结束反应程序。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,之后交由南京擎科生物技术有限公司进行测序。1.5.38gyrB基因序列系统发育树构建对分离菌的gyrB基因序列通过 NCBI的Blast目标基因CCTATGGCCTGAGCGAGAAGLaerCCAGTTCCAGTCCCACCACTGCGGTTTATCGCTTTGGTom
16、pACACGCTTGGACTTGCTGAGGCTATTGCTATCCCGGCTCTGTTahaCGGTCCACTCGTCGTCCATCTTGACCCGTCTGTATCGTTTCCCflaHCGTCCAGCGAGCTGTTGAGGTGCCGTCTGCCTTGGTGAlipCCCGTCTATTGCGGGTTCGAAGAAGGTGACCACCAAGAACAactAACTGACATCGGCCTTGAACTCTGACCCAGTCCTGGCACGGCaltGGTGATCGATCACCACCAGC汤环宇等:泗洪地区克氏原螯虾病原维氏气单胞菌鉴定及致病性分析胞外酶与溶血活性检测采用平板法测定分离菌CPA202
17、0的卵磷脂酶、脂酶、明胶酶、脲酶以及溶血素活性。吸取10 L分离菌CPA2020分别点种在含10%卵黄液、1%吐温8 0、1%明胶、2%尿素(含酚红指示剂)以及7%兔脱纤血的固体培养基上,于2 8 恒温倒置培养2 4h。实验均重复3次,根据是否出现透明圈判定酶活性。若有水解圈产生,则反应为阳性。1.8毒力基因检测根据GenBank已登录的维氏气单胞菌的毒力基因,实验选择flaA、a e r、o mp A、a h a、f l a H 等16个常见毒力基因,采用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物,由上海生物工程技术公司合成(表1),以检测分离菌几种毒力基因的携带情况。表1实验选择毒
18、力基因引物序列Tab.1Primers for the virulence gene引物序列(5-3)63进行同源性检索,并使用ClustalX2.0软件与从GenBank数据库下载相似性较高的菌株的序列进行多序列比对(multiple alignments),并对gyrB基因采用MEGA7.0软件构建系统发生树,选用邻接(neighbor joining method)法构建系统发育树。1.6克氏原螯虾的病理组织分析分别取健康、自然患病及人工感染的克氏原螯虾各5只,将解剖出的克氏原螯虾肝胰腺用波恩氏液固定2 4h后,使用7 0%酒精保存,克氏原螯虾肝胰腺组织经脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋一系列
19、操作后,使用切片机连续切片(36 m),之后进行H-E染色,中性树脂胶封片,最后使用显微镜观察记录。1.7月目标片段长度/bp417397998640598232442登录号MH332385CP032839CP028568CP032839CP03283934 34+2.110CFU/mL64目标基因asttapAserexuhlyfIgAflgMflgNfim1.9病原菌耐药性性测定取供试分离菌,移接于普通营养肉汤中培养18h,后将菌株悬液均匀涂布于LB琼脂平板上,待自然干燥后平贴各药敏纸片,每个平板均匀分布贴6 张,置于2 8 生化培养箱中培养2 4h后观察并记录结果。参照杭州滨和微生物试剂
20、有限公司药敏纸片抑菌圈标准,以测量的抑菌圈直径大小为指标判定其敏感与耐药性。2实验结果2.1克氏原螯虾疾病发生情况人工感染后的病虾与自然发病虾的症状相同,表现为行动迟缓,对外界刺激反应迟钝,头胸部与腹部间肌肉松软,头胸甲和肌节容易分离(图1a),外观可见其心脏积液(图1b),腹部肌肉肿胀(图1c),肝胰腺水肿,颜色加深(图1d)。aea:健康虾头部;b:病虾头部;c:健康虾心脏;d:病虾心脏;e:健康虾腹部;f:病虾腹部;g:健康虾肝胰腺;h:患病虾肝胰腺淡水渔业引物序列(5-3)TCTCCATGCTTCCCTTCCACTGTGTAGGGATTGAAGAAGCCGATGACCTCTAGCCCC
21、AATAACCCGATTGATTTCTGCCCTCCTACTCCAGCGTCGGCGATCGTCGGTGCGGTTGT(A/G)GACATGCACAACCTCTTCCGATTGGTATTGCC(C/T)TGCAA(C/G)CGGACGATTATCAGGATGGCAAGAACGAGTTTCAGTGGCGGGACCTGCTGAGTGAAAGACCGATACGGCACCTACGCTACTGTCAAGCTGGACTCAGATTGGCCTCGAAACTGAGTTGCTTGCTGCGATAGAAGACGACGGTTTGAGACGTGCCCGTTCGCCTCTTTAGGCTTCGGTCTTGCCATTCdf
22、g图1患病克氏原螯虾临床症状Fig.1 The clinical signs of diseased P.clarki2023 年续表1目标片段长度/bp登录号3313455034 1283532335 289KY624579326CP032839194CP032839181CP032839110CP0328392.2病原菌的致病性低浓度组在观察期内持续发病死亡;对照组克氏原螯虾在5d的观察期内均未出现死亡(图2)。计算得分离菌对克氏原螯虾的半致死量为6.3110CFU/mL。证明分离菌对克氏原螯虾具有较高致死率,并从人工感染死亡克氏原螯虾体内分离到大量优势原感染菌。10080%/率60402
23、000图2菌株CPA2020对克氏原螯虾人工感染实验结果Fig.2 The artificial infection experiment results of strainCPA2020 on P.clarkii2.3病原菌的鉴定菌株CPA2020的生理生化特性鉴定结果见表h2,分离菌能够在37 中生长,具有动力,能利用蔗糖、精氨酸双水解酶、甘露糖等,这与Be r g e y s M a n u a l o f D e t e r mi n a t i v e Ba c t e r i o l o g y 33 申维氏气单胞菌的理化特性描述基本一致。初步鉴定菌株CPA2020为维氏气单胞菌。
24、对其gyrB基因序列进行扩增、测序,在 NCBI+2.110CFU/mL+2.110CFU/mL+2.110CFU/mL+2.110*CFU/mL-PBS12时间/d345第4期中进行Blast同源性检索,发现其gyrB基因序列与维氏气单胞菌的同源性最高(10 0%)。选取不同气单胞菌属的代表株gyrB基因序列构建系统发育树(图3)。结果显示,CPA2020与维氏气单胞菌100CPA202092lA.veroni(KR537457.1)0.1图3基于CPA2020gyrB序列构建的气单胞菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Aeromonas based on C
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