四磨汤对功能性消化不良大鼠CNP_NPR-B_cGMP信号通路的影响.pdf
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1、目的通过研究四磨汤对功能性消化不良(functionaldyspepsia,FD)模型大鼠CNP/NPR-B/cGMP信号通路的影响,进一步探讨其作用机制。方法将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、低浓度四磨汤组、中浓度四磨汤组、高浓度四磨汤组以及莫沙必利组。参考文献中的方法使用夹尾刺激联合不规则饮食14d制备FD大鼠模型。造模结束后,四磨汤低、中、高浓度组大鼠分别灌胃1.8、2.4、3.6 g/kgd)剂量的四磨汤药液,莫沙必利组灌胃0.30 5mg/kgd)剂量的莫沙必利药液,对照组和模型组给予等体积蒸馏水,给药14d。观测大鼠体质量变化;酚红法检测大鼠胃排空率;碳粉法检测大鼠小肠推进
2、率;ELISA法检测血清中胃动素(motilin,M T L)、胃泌素(gastrin,G A S)、胃窦平滑肌C型利钠肽(C-type natriuretic peptide,C NP)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosinemonophosphate,cGMP)的含量;RT-qPCR和Western blot分别检测胃窦平滑肌CNP、B型尿钠肽受体(typeBurinary natriuretic peptidereceptor,NPR-B)的基因和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠体质量降低(P0.05),胃排空率与小肠推进率明显减弱(R0.05),血清MTL、G A S含量降
3、低(P0.05),胃窦平滑肌CNP、c G M P含量升高(P0.05),CNPNPR-B的mRNA和蛋白表达增加(P0.05)。与模型组相比,四磨汤各剂量组大鼠体质量显著增加(P0.05),胃排空率和小肠推进率显著提高(P0.05),血清MTL和GAS含量显著增加(P0.05),胃窦平滑肌CNP、c G M P含量降低(P0.05),CNP、NPR-B的mRNA和蛋白表达降低(P0.05)。结论四磨汤通过抑制CNP/NPR-B/cGMP信号通路以促进胃肠动力可能是其治疗FD的作用机制之一。【关键词】功能性消化不良;四磨汤;CNP/NPR-B/cGMP信号通路;大鼠;胃排空率;小肠推进率【中图
4、分类号 R285.5【文献标志码】A【文章编号 doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2023.07.003Effects of Simo Decoction on CNP/NPR-B/cGMP signaling pathway inrats with functional dyspepsiaZHOU Sainan,LIN Xiaoyuan,CHEN Siqing,ZHOU Shu,HAN Yunzong,LIU Qin,FU Jid*1.The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha
5、,Hunan 410007,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,ChinaAbstract Objective To investigate the effects of Simo Decoction on CNP/NPR-B/cGMP signaling pathway in rats offunctional dyspepsia(FD)model,so as to further explore its mechanism of action.Methods Wistar rats were
6、randomly divided intocontrol group,model group,mosapride group,low-,medium-,and high-dose Simo Decoction groups.The FD rat model wasestablished by tail-clipping stimulation combined with irregular diet for 14 d.After modeling,the rats in low-,medium-,and high-dose Simo Decoction groups were intragas
7、trically administered with 1.8,2.4,and 3.6 g/(kg-d)Simo Decoction,respectively.Mosapridegroup was received 0.305 mg/(kgd)mosapride solution by gavage,while control and model groups were given an equal volume of【收稿日期 2 0 2 3-0 1-13【基金项目】湖南省中医药科研计划重点项目(2 0 2 12 0 3);湖南省自然科学基金科卫联合项目(2 0 2 2 JJ70031);湖南
8、中医药大学中医学一流学科开放基金项目(2 0 18 ZYX13);湖南中医药大学中医学国内一流学科项目(49 0 1-0 2 0 0 0 0 2 0 0 2 0 5)。【第一作者 周赛男,女,副主任医师,博士,研究方向:中医药防治消化系统疾病的研究。【通信作者*符佳,女,硕士,主治医师,E-。1166distilled water,and all the administration lasted for 14 d.The changes in body weight of the rats were observed;the gastricemptying rate was measured
9、 by the phenol red method;the small intestinal propulsive rate was measured by the carbon powdermethod;the levels of motilin(MTL),gastrin(GAS),C-type natriuretic peptid(CNP),and cyclic guanosine monophosphate(cGMP)inserum were determined by ELISA;the gene and protein expressions of CNP and Type B ur
10、inary natriuretic peptide receptor(NPR-B)in gastric antrum smooth muscle were examined by RT-qPCR and Western blot,respectively.Results Compared with controlgroup,the rats in model group showed a decrease in body weight(P0.05),significantly decreased gastric emptying and smallintestinal propulsive r
11、ates(P0.05),lower MTL and GAS levels in serum(P0.05),higher CNP and cGMP levels in gastric antrumsmooth muscle(P0.05),and increased mRNA and protein expressions of CNP and NPR-B(P0.05).Compared with model group,thebody weight,gastric emptying rate,small intestinal propulsive rate,and the levels of M
12、TL and GAS in serum in Simo Decoctiongroups were significantly higher(P0.05),while the levels of CNP and cGMP in gastric antrum smooth muscle and mRNA andprotein expressions of CNP and NPR-B were lower(P0.05).Conclusion Simo Decoction may exert its therapeutic effects on FD byinhibiting CNP/NPR-B/cG
13、MP signaling pathway and promoting gastrointestinal motility.Keywords functional dyspepsia;Simo Decoction;CNP/NPR-B/eGMP signaling pathway;rats;gastric emptying rate;small intestinal propulsive rate功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是生活中比较常见的功能性胃肠疾病之一,通常与食物摄人有关。有统计发现,FD全球综合患病率为21.8%,近年来呈上升趋势2。现阶段,国内外对F
14、D发病机制的认识还不统一,一般认为是多种因素综合作用的结果。如胃肠动力出现功能性障碍、内脏神经敏感性升高、感染幽门螺杆菌及精神压力增大等,导致病发核心环节脑肠轴功能发生紊乱,胃肠激素分泌异常,继而引起FD 症状3-1。利尿钠肽(natriureticpeptide,NP)家族中的C 型利尿钠肽(CNP)主要存在于血管内皮细胞中,涉及血管平滑肌的松弛以及细胞增殖和迁移的调节等功能。研究显示,CNP通过细胞外液传递,可以作用于胃肠道平滑肌上的B型利尿肽受体(type B urinary peptide receptor,NPR-B),并与之结合,导致环磷酸鸟苷(cyclicguanosinemon
15、ophosphate,cGMP)含量提升,进而激活CNP/NPR-B/cGMP通路,促进平滑肌舒张 7-9 。CNP/NPR-B/cGMP信号通路状态的改变,与胃肠道运功失调以及FD有着密切的联系 0。针对FD,现代医学治疗多以质子泵抑制剂、组胺2 受体拮抗剂、促动力剂和中枢神经调节剂等药物进行干预2,疗效显著,毒副作用同样明显,如质子泵抑制剂与组胺2 受体拮抗剂等药物,长期使用会抑制胃酸产生,引发维生素B12吸收不良!。此外,部分人会产生头痛、腹胀、恶心等现象12 。以辨证论治理念为主的中医学,在治疗FD时有着独特的效果,毒副作用弱,效果明显 13-15。中医学上将FD辨证分为肝脾气滞证、肝
16、郁脾虚证、脾胃虚寒证、肝胃不和湖南中医药大学学报http:/2023年第43卷证、寒热错杂证和脾胃湿热证等多种证型。FD与肝、脾密切相关,肝气郁结会导致脾胃升降失司,从而导致脾胃运动功能失调,导致FD肝脾气滞证的发生,因此,肝脾气滞证是FD的一个重要分型17 。四磨汤是治疗肝脾气滞证FD的一种常用中成药 8-2 0 1,最早出自严氏济生方,由人参、乌药、槟榔、沉香组成,有破气降逆的功效,用于治疗FD作用确切,效果明显 4,但机制不明。因此,为了进一步明确四磨汤治疗FD的作用靶点,本研究通过复制肝脾气滞证FD大鼠模型,观察四磨汤对胃动素(motilin,MTL)、胃泌素(gastrin,G A
17、S)及 CNP/NPR-B/cGMP信号通路的影响,现报道如下。1材料1.1动物从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买42只SPF级Wistar大鼠(体质量18 0 2 2 0 g)。适应性饲养1周,饲养条件:温度2 2、湿度50%6 0%,所有大鼠自由饮食、饮水。本研究经湖南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会批准(审批号:ZYFY20201015),实验动物使用许可证号:SCXK(湘)2 0 19-0 0 0 4。1.2药物四磨汤中药饮片:人参6 g、乌药6 g、槟榔9 g、沉香6 g,均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房,经鉴定符合中华人民共和国药典标准,按传统方法煎煮浓缩成高、中、低不
18、同浓度的药液备用。莫沙必利:片剂,5mg/片(江苏豪森药业集团有限公司,生产批号:12 42 2 0 50 2)。2023年第43卷1.3主要试剂与仪器琼脂糖(西班牙BIOWEST,批号:1118 6 0);mRNA逆转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司,批号:CW2569);NPR-B Rabbit Antibody(55113-1-AP)山羊抗小鼠二抗(批号:SA00001-1)、山羊抗兔二抗(批号:SA00001-2)均购自美国Proteintech公司;胃动素motilin,M T L,批号:CSB-E08208r)、胃泌素(gastrin,G A S,批号:CSB-E12743r
19、)均购自武汉华美生物工程有限公司;cGMP(批号:ml003133)、NPR-B(批号:ml003270)均购自上海酶联生物科技有限公司。2方法2.1分组与模型制备将Wistar大鼠随机选取7 只作为对照组,其余实验组大鼠均参照文献 2 1-2 2 中的方法复制肝脾气滞证FD模型:每天(7:0 0、10:0 0、13:0 0、16:0 0)于大鼠尾巴远端三分之一处用鼠夹夹住,力度适中,避免破皮,每次刺激大鼠约0.5h。实验期间,大鼠正常饮水,隔日禁食,持续14d。将造模处理过的大鼠随机分为模型组、低浓度四磨汤组、中浓度四磨汤组、高浓度四磨汤组、莫沙必利组,每组7 只。通过大鼠行为学、胃排空率及
20、小肠推进率判断是否造模成功 2 1-2 3。2.2给药与取材从第15天开始动物给药,给药剂量以成人每天用量按体表面积法 2 4换算成大鼠的等效剂量,四磨汤低、中、高浓度组大鼠分别灌胃1.8、2.4、3.6 g/(kgd)剂量的四磨汤药液,莫沙必利组灌胃0.30 5mg/(kgd)剂量的莫沙必利药液,每天灌胃1次,灌胃容积均为1 mL/100g体质量。对照组和模型组予以等剂量蒸馏水灌胃,连续14d。禁食2 4h后末次给药,给药1h后灌胃胃排空和小肠推进试验所用溶液,0.5h后用3%戊巴比妥钠5mL/kg腹腔注射麻醉,麻醉完成后剖开腹腔,肝门静脉取血,将全血标本置于室温静置2h后于430 0 0
21、r/min离心15min,离心半径为9cm,吸取上清液,于-8 0 条件下保存。随后进行胃排空和小肠推进试验,然后漂洗胃窦组织,一部分放人多聚甲醛中固定,另一部分生理盐水漂洗后放于液氮中速冻5min,随后于-8 0 冰箱中保存。2.3指标检测2.3.1一般状态观察湖南中医药大学学报http:/在显微镜下观察。2.3.4ELISA检测血清中MTL、G A S和胃窦组织中CNP、c G M P的含量取出-8 0 血清消融,采用ELISA法检测大鼠血清中MTL、G A S的浓度。取小部分胃窦平滑肌样本消融,用1xPBS将残留在样本上血污洗去,剪成小块放,再加入1xPBS,匀浆,反复消融匀浆液,然后过
22、夜,次日2 8 50 0 0 r/min,离在整个实验期间,定期观察心5min,离心半径为9 cm,取上清液待测。采用1167大鼠状态,记录体质量变化,根据体质量计算大鼠的增重。2.3.2胃排空率和小肠推进率测定 2 5 每组大鼠随机挑选3只,使用酚红-甲基纤维素溶液2 mL(25mg酚红溶人50 mL1.5%甲基纤维素溶液中)灌胃,0.5h之后麻醉大鼠,剖开腹部,捆扎幽门和胃责门,取出完整鼠胃,然后沿胃大弯将胃剖开,使用蒸馏水对鼠胃内容物进行冲洗,并将冲洗液定容至2 0 mL。再加人等体积0.5mol/LNaOH溶液,混匀,放置1h。取5mL上清液,加人0.5mL20%三氯乙酸,于350 0
23、 r/min,离心半径为9 cm,离心10 min,取上清液,用分光光度计测定其吸光度(A)。另取10%酚红-甲基纤维素溶液2 mL,依次加人18 mL蒸馏水、2 0 mL0.5mol/LNa0H溶液,以及4mL20%三氯乙酸混合均匀,测定吸光度(A)。大鼠胃排空率=(1-实测酚红A/标准酚红A值)10 0%。各组剩余的4只大鼠禁食24h后,按照1mL/100g体质量用量,使用炭粉混悬液(10%活性炭+10%阿拉伯胶)灌胃,0.5h之后麻醉大鼠,剖开腹腔,用镊子取出整个小肠,于托盘上缓缓拉直,再用直尺测量幽门至回盲部的肠管的小肠推进指标,小肠推进率=炭粉前端至幽门括约肌距离(cm)/幽门括约肌
24、至小肠末端距离(cm)100%。2.3.3HE染色将胃黏膜组织进行石蜡包埋并切片,然后放入6 0 下烤片12 h。在二甲苯中浸泡3次,每次2 0 min。随后,分别在10 0%、10 0%9 5%、8 5%、75%乙醇溶液中浸泡5min,并用蒸馏水洗涤5min。将切片先用苏木素染色3min,用PBS洗涤再返蓝。接着再用伊红染色3min,再次用蒸馏水洗涤。最后将切片放入梯度乙醇(9 5%10 0%)中进行脱水,每个梯度浓度的乙醇持续5min。脱水后,连续两次放入二甲苯中10 min清洗,最后用中性树胶包埋,并1168ELISA检测试剂盒检测大鼠胃窦平滑肌CNP与cGMP的含量。具体步骤按照ELI
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