木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白N端保守脯氨酸对病毒致病性的影响.pdf
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1、木尔坦棉花曲叶病毒()是棉花曲叶病的主要病原之一其 蛋白在病毒致病过程中起重要作用 本研究对 蛋白 端第 位脯氨酸在病毒致病过程中的作用进行了分析 通过构建马铃薯 病毒()异源表达载体(、)利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现 能够增强 异源病毒的致病性致使 在植物体内复制量增加而 对 异源病毒致病性的影响相对较小 通过构建 基因突变体(、)侵染性克隆利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现、侵染性克隆引起的症状较野生型更弱 结果表明 开放科学(资源服务)标识码()蛋白 端第 位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用关键词:木尔坦棉花曲叶病毒 蛋白 致病性 载体 侵染性克隆中图分类号:.文献标识码:文章
2、编号:():./.(.).(./.):().().().().:木尔坦棉花曲叶病毒()属于菜豆金色花叶病毒属()具有单组分单链环状 基因组是棉花曲叶病的主要病原物之一 该病毒在自然条件下主要由烟粉虱()传播还可以通过嫁接、扦插等农事传播危害多种农作物和园艺植物给多国的农福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 第 期 ()年 月业生产造成严重的经济损失 年我国首次在广东朱瑾()上检测到 随后福建、海南、广西、江苏等地也发现该病毒其危害棉花(.)、黄秋葵()、红麻()、垂花悬铃花()等植物 是双生病毒中分布最广、种类最多、危害程度最大的属具有孪生颗粒状病毒粒子形态基因组为 该属中部分成员是双组分基因
3、组结构包括 和 多数是单组分基因组结构只有一条 组分大小为.包含 个开放阅读框()和 蛋白由病毒链编码、和 蛋白由互补链编码 卫星分子的 大小约.只编码 蛋白 蛋白是 单组分病毒编码的一个保守蛋白在病毒侵染寄主和致病过程中起着重要作用 在本氏烟()中过表达非洲木薯花叶病毒()或番茄黄曲叶病毒()编码的 蛋白会引起寄主叶脉黄化、植株矮缩、叶片卷曲的症状 基因的突变可以使寄主症状减轻、病毒 积累量骤减甚至阻断病毒在寄主体内的侵染过程但在侵染本氏烟原生质体时 基因的突变不影响病毒的 复制 多种病毒的 蛋白被鉴定为转录后基因沉默()抑制子和/或转录水平基因沉默()抑制子 研究发现 蛋白通过与基因沉默抑
4、制子()或核酸内切酶()互作抑制基因沉默 另外 蛋白可诱导寄主产生过敏性坏死反应且参与病毒的运动 研究还发现 蛋白可能通过与木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶 互作参与寄主的过敏性坏死反应本课题组前期研究发现 蛋白 端可影响病毒的致病性而具体哪个氨基酸起作用尚不清晰 本研究对该病毒 蛋白 端第 位保守脯氨酸对病毒致病性的影响进行研究以期为进一步理解 蛋白的功能提供依据 材料与方法.材料 侵染的朱槿样品总、侵染性克隆(序列登录号为 序列登录号为)、马铃薯 病毒()载体、农杆菌()感受态、大肠杆菌()感受态、蛋白多克隆抗体、本氏烟种子均由本实验室保存同源重组酶试剂盒()和高保真酶试剂盒()购自南京诺唯赞生
5、物科技股份有限公司 试剂盒()和蛋白酶抑制剂片剂购自 公司 植物总 提取试剂盒()购自天根生化科技(北京)有限公司反转录试剂盒()购自 公司荧光定量()快速反应体系()购自北京康润诚业生物科技有限公司.异源表达载体构建以 侵染的朱槿样品总 为模板设计特异性引物/和/(表)分别扩增野生型和第 位脯氨酸突变型(脯氨酸 突变为丙氨酸)目的基因片段 反应体系:总 引物()引物()聚合酶 缓冲液 混合物 总体积 反应程序:个循环后 终止反应 将由 线性化的 载体和 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及回收纯化后按照同源重组酶试剂盒说明书进行同源重组重组产物转化至大肠杆菌使用/引物(表)进行阳性克隆筛选获得重组质粒
6、 和 第 期尚鹏祥等:木尔坦棉花曲叶病毒 蛋白 端保守脯氨酸对病毒致病性的影响表 本研究所用引物)引物名称引物序列()引物序列中小写字母代表重组位点下划线处代表突变位点.突变型侵染性克隆载体构建用限制性内切酶 和 将 侵染性克隆载体中 基因组切除保留部分缺失基因组 和载体部分片段 设计引物/、/(表)扩增 基因突变(缺失突变和 第 位脯氨酸 突变为丙氨酸)的 基因组片段延伸时间改为 扩增得到的条带大小均为 将 扩增产物和酶切产物经琼脂糖凝胶电泳及回收纯化后分别进行同源重组重组产物转化至大肠杆菌后利用引物/(表)进行阳性克隆的筛选获得的重组质粒 和 即为 缺失突变体和 突变体侵染性克隆.重组质粒
7、转化和接种将重组质粒、空载体、分别利用液氮冻融法转入农杆菌 感受态细胞 吸取 阳性菌液加入 含有 和 抗生素的液体 中、摇床培养至 .离心 弃上清加入 接种缓冲液 吗啉乙磺酸(.)乙酰丁香酮 重悬后 离心 弃上清重复两次加入接种缓冲液悬浮至 为.室温静置 选择生长至 片叶的本氏烟使用去除针头的医用接种器通过浸润法接种适量菌液至叶片背部(侵染性克隆接种时、需要分别与 等比例混匀)接种后的本氏烟置于 光照培养箱培养定期观察植株症状使用单反相机(尼康)拍照.植物总 的提取和 检测采用改良 法提取植物总 参考 试剂盒说明书进行 检测 以引物/(表)扩增的 部分片段()作为探针以引物/(表)扩增的 部分
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