马氏珠母贝α-Tubulin基因结构、SNP筛选及耐低温相关性分析.pdf
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1、为了探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)-Tubulin 基因在低温适应性中的作用,通过 RACE克隆技术获得马氏珠母贝-Tubulin 基因,分析了-Tubulin 基因在低温胁迫下的表达趋势,并筛选和比较了马氏珠母贝耐低温选育系(R)F3 和北部湾野生群体(W)的-Tubulin 编码区 SNP 位点。结果表明:马氏珠母贝-Tubulin 基因总长为 2 107 bp,可编码 454 个氨基酸,具有典型的 Tubulin 和 Tubulin-C 结构域;全组织定量显示,-Tubulin 基因在所有组织中均有表达,在足部中表达量最高(P0.05);低温胁迫时,
2、鳃组织中-Tubulin 基因在低温组(12、17)的表达量均在 72 h 时达到最高,且显著高于对照组(22)(P0.05);-Tubulin 外显子区域共有34 个 SNP,其中3 个 SNP 位点的基因型频率在 R 和 W 群体间有显著性差异(P0.05);连锁不平衡分析显示,R 群体单倍型 CCTCAGCGCC 的频率明显高于 W 群体。研究表明,-Tubulin 为参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,筛选出的与抗低温性状相关的SNP 位点 g.111071125 及优异单倍型 CCTCAGCGCC,可作为选择育种的候选标记。关键词:马氏珠母贝;-Tubulin 基因;SNP;
3、低温耐受中图分类号:S 917.4 文献标志码:A 微管(microtubule)是真核生物细胞骨架的主要成分,参与保持细胞形态、运动、分裂,以及胞内物质运输和分泌等重要的生物学过程1。近年研究 显 示,微 管 结 构 与 逆 境 应 答 也 有 密 切 关系2-3。-微管蛋白(-Tubulin)作为微管主要成分之一,在生物生长过程中的调控作用受到关注4。研究表明,细胞骨架可能是水生生物低温损伤的重要位点之一5-6。海参的再生功能也与-Tubulin 关系密切7。目前,已经鉴定了 7 种微管蛋白,包括微管蛋白、和 8-9,微管蛋白由多基因编码,不同微管蛋白的功能还有待进一步研究10-12。马氏
4、珠母贝(Pinctada fucata martensii)属暖水性贝类,低温耐受能力弱,冬季寒潮导致的大规模死亡对马氏珠母贝海水珍珠养殖产业造成了严重影响。其中,2008 年 12 月受特大寒潮影响,广东省湛江流沙湾 70%的珍珠贝死亡(据湛江市珍珠协会资料,未发表)。因此,水温是马氏珠母贝养殖区域的重要限制性因子,培育马氏珠母贝耐低温品系是开展珍珠贝北移养殖及扩展珍珠贝养殖区域的前提。本课题组自 2013 年起致力于培育马氏珠母贝耐低温选育系,目前已经选育至 F3 代,通过对耐低温选育系 F1 和对照群体的转录组分析发现,马氏珠母贝-Tubulin 基因在耐低温品系中表达上调13,说明该基
5、因可作为马氏珠母贝耐低温的候选基因。筛选与抗低温相关的 DNA 分子标记应用于分子辅助育种,可加速抗寒性遗传改良进程。单核苷酸多态性(single nucleotide polymor-phism,SNP)作为遗传育种研究的首选标记之一,具有多态性高、分布广泛及遗传稳定性与准确性高的优点14-15。因此,对-Tubulin 进行 SNP 多态性分析,探究其与耐低温能力的关系,有助于进一步 收稿日期:2022-09-02 基金项目:广东省教育厅重点领域专项(2020ZDZX1045);广东省自然科学基金(2020A151501691);广东省现代农业产业技术体系-贝藻类产业创新团队(KJ146)
6、作者简介:刘雅(1993),女,研究实习员。E-mail:liuya_ zj 李松谕(1992),女,助理研究员。E-mail:lsyu 。刘雅与李松谕为共同第一作者。通信作者:王庆恒(1977),男,教授。E-mail:wangqh 培育马氏珠母贝耐低温品系。本研究中,通过RACE 克隆技术获得马氏珠母贝-Tubulin 基因,对其进行了生物信息学分析,同时分析了其组织表达模式、低温胁迫下鳃组织的时序表达模式及 SNP位点,以期为开展贝类对不良环境的适应性研究提供基础数据。1 材料与方法1.1 材料试验 用 马 氏 珠 母 贝 活 力 较 强,壳 长 为69.23 mm3.80 mm,采自广
7、东省雷州市后洪村海区。1.2 方法1.2.1 试验设计及样品采集随机取 8 只试验贝的全组织,经液氮速冻后于-80 超低温冰箱中保存备用。其余试验贝在室温中适应 2 d,清除死贝及明显不健康的贝后,将 150 只试验贝随机平分为3 组。3 组试验贝分别用锥形笼吊于 3 个 300 L 的养殖桶养殖。采用控温系统控制水温,设置 12、17 低温组和 22 对照组。养殖过程中每天投喂等量的单胞藻。在控温开始后 6、24、72、120 h时,从每组随机取 8 只贝剪取鳃,经液氮速冻后于-80 超低温冰箱中保存备用。1.2.2-Tubulin 基因的克隆 利用巢式 PCR 扩增获得-Tubulin 的
8、 3和 5序列。PCR 目的产物经连接后转化至 DH5 中,用氨苄选择培养基培养,挑取阳性菌测序。将-Tubulin 3和 5测序结果与马氏珠母贝基因组中的-Tubulin 序列16拼接得到全长序列。用 Primer Primer 5.0 软件设计巢式 PCR扩增引物及荧光定量 PCR 引物(表 1)。表 1 引物序列Tab.1 Primer sequences 引物 primer用途 purpose序列(5-3)sequence(5-3)5 primer5RACEF:CGTAGTTATTGGCAGCGTCR:GCTGTGGAACACCAAGAA3primer3RACEF:FGTGAGTTTT
9、CTGAAGCCAGGGAGR:CTACCAGCCGCCAACTAT-TubulinqRT-PCRF:GAGGACGCTGCCAATAACR:ATCTGTGGTGCGGGGTAT1.2.3生物信息学分析采用 DNAMAN 推导-Tubulin 编码的氨基酸序列;分别使用 ORF Finder、ExPASy-ProtParam tool、SignalP 4.1 及TMHMM Serv-er 软件预测-Tubulin 的开放阅读框、氨基酸理化性质、信号肽及跨膜结构。1.2.4-Tubulin 基因的 SNP 筛选用于 SNP 筛选的马氏珠母贝来自第三代耐低温品系17,2018年 10 月,从耐低温
10、选育系(R)F3 和北部湾野生群体(W)中分别随机取 30 个个体,剪取其闭壳肌装于冻存管,用液氮速冻后置于-80 超低温冰箱中备用。提取 R 和 W 群体闭壳肌的 DNA,通过重测序用于-Tubulin 基因的 SNP 筛选。1.2.5 SNP 位点的遗传多态性及低温耐受性分析采用 Popgene 32 软件计算等位基因数、期望杂合度(He)、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、哈迪-温伯格平衡(HWE)及观测杂合度(Ho);采用 PIC_ CALC 软件计算 SNP 位点的多态信息含量(PIC)。采用 SPSS 22.0 软件进行卡方检验,对 SNP 位点与马氏珠母贝的低温耐受性状做关联
11、分析;采用 Haploview 4.2 软件计算 R2和 D值,并进行连锁不平衡和单倍型分析。1.3 数据处理以-actin 为内参基因,采用 2-Ct法计算-Tubulin 的相对表达量。采用 SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析,用 Tukey 法进行组间多重比较,显著性水平设为 0.05。2 结果与分析2.1-Tubulin 序列通过 RACE 技术获得的-Tubulin 全长序列长度为2 107 bp,5 UTR 为75 bp,3 UTR 为 667 bp,开放阅读框(ORF)为 1 365 bp,编码 454 个氨基酸(图 1)。预测-Tubulin 蛋白无信号肽、无跨膜结构,
12、具有典型的 Tubulin 和 Tubulin-C 结构域。2.2-Tubulin 氨基酸序列进化树的构建将马氏珠母贝-Tubulin 氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)等 15 个物种的-Tubulin 氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,马氏珠母贝与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)聚为一支,说明二者亲缘关系较近(图 2)。2.3-Tubulin 基因的组织表达从图 3 可见,-Tubulin 基因在马氏珠母贝各组织中均有表达,在足中表达量最高(P0.05),其次是鳃,闭壳肌中表达量最低(P0.05)。704第 3 期刘雅,等:马氏珠母贝-Tubulin 基因
13、结构、SNP 筛选及耐低温相关性分析5和 3非编码区用小写字母表示;开放阅读框及推导的氨基酸序列用大写字母表示;黑色下划线和蓝色下划线部分分别为保守结构域Tubulin 和 Tubulin-C。5 UTR and 3 UTR are indicated with small letters;open reading frame and the deduced amino acid sequences are indicated with capital letters;the underlined part which in black and blue are respectively th
14、e conservative domains Tubulin and Tubulin-C.图 1 马氏珠母贝-Tubulin 核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of-Tubulin in Pinctada fucata martensii图 2-Tubulin 系统发育树 Fig.2 Phylogenetic trees of-TubulinGO性腺;HE肝胰腺;GI鳃;M外套膜;F足;A闭壳肌。标有不同字母者表示组间有显著性差异(P0.05)。GOgonad;HEhepato
15、pancreas;GIgill;Mmantle;Ffoot;Aadductor muscle.The means with different letters are significant-ly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences.图 3-Tubulin 在马氏珠母贝不同组织中的相对表达量Fig.3Relative expression level of-Tubulin in differ
16、-ent tissues of Pinctada fucata martensii2.4 马氏珠母贝鳃中-Tubulin 基因的时序表达从图 4 可见,马氏珠母贝在低温胁迫下,-804大连海洋大学学报 第 38 卷Tubulin 基因表达量呈先升高后降低的变化趋势,12、17 低温组均在 72 h 时表达量达到最大值,且显著高于对照组(22)(P0.05)。标有不同字母者表示同一时间点不同温度组间有显著性差异(P0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05
17、 probability level,and the means with the same letter are not significant differences.图 4 12、17、22 下马氏珠母贝鳃中-Tubulin 基因的时序表达 Fig.4Temporal expression of the-Tubulin gene in the gills of Pinctada fucata martensii at 12,17 and 22 2.5-Tubulin 基因 SNP 位点的遗传多态性-Tubulin 外显子具有 34 个 SNP 位点,对 SNP位点的遗传信息分析显示:PI
18、C 为0.016 30.358 9,其中,低度多态性 SNP 位点(PIC 0.25)有26 个,中度多态性 SNP 位点(0.25PIC0.5)有 8 个;Ho为 0.016 70.550 0;He为 0.016 70.472 7(表 2)。对-Tubulin 基因 34 个 SNP 位点的连锁不平衡分析发现,有 5 对位点完全连锁不平衡(D=1,R2=1),91 对强连锁不平衡(0.8D1,0.3R21),123 对弱连锁不平衡(D0.8,R20.3)(图 5)。2.6 SNP 位点与低温耐受性的关联分析在 34 个 SNP 位点中,W 和 R 群体中存在显著性差异的位点包括 g.1110
19、71109、g.111071125 和位点 g.111071133,说明这 3 个位点可能与低温耐受性状相关,其中,位点 g.111071109 的基因型 GT、位点 g.111071125 的基因型 AC 和位点 g.111071133的基因型 AG 仅在 R 群体中被检测到(表 3)。利用 Haploview 4.2 软件对-Tubulin 外显子区的 SNP 进行连锁不平衡分析,结果显示,34 个位点构成 3 个单倍块和 14 种单倍型,其中,单倍型CCTCAGCGCC 与马氏珠母贝耐低温性状显著相关(P0.05)(表 4)。表 2-Tubulin 基因的 SNP 多态性Tab.2 Po
20、lymorphism analysis of SNP in-Tubulin gene序号No.位点position观测杂合度Ho期望杂合度He有效等位基因数 Ne多态信息含量PIC哈迪-温伯格平衡HWE1g.111068692 0.200 00.181 5 1.219 50.163 80.411 72g.111068708 0.016 70.016 7 1.016 80.016 31.000 03g.111068716 0.250 00.220 6 1.280 00.194 80.286 84g.111068725 0.500 00.436 4 1.763 00.339 10.253 85g.
21、111068733 0.266 70.233 1 1.300 60.204 40.250 36g.111068736 0.250 00.220 6 1.280 00.194 80.286 87g.111068762 0.250 00.220 6 1.280 00.194 80.286 88g.111068783 0.250 00.220 6 1.280 00.194 80.286 89g.111069388 0.183 30.194 8 1.239 50.174 50.635 810g.111069415 0.216 70.194 8 1.239 50.174 50.367 711g.1110
22、69469 0.200 00.181 5 1.219 50.163 80.411 712g.111069478 0.216 70.194 8 1.239 50.174 50.367 713g.111069897 0.216 70.194 8 1.239 50.174 50.367 714g.111069921 0.433 30.394 4 1.642 30.314 60.438 415g.111069981 0.033 30.065 0 1.068 90.062 30.000 016g.111070283 0.233 30.233 1 1.300 60.204 40.992 417g.1110
23、70352 0.466 70.394 4 1.642 30.314 60.150 418g.111070547 0.433 30.423 5 1.724 10.331 80.856 019g.111070578 0.183 30.194 8 1.239 50.174 50.635 820g.111070601 0.300 00.257 1 1.342 30.222 50.185 621g.111070649 0.200 00.207 8 1.259 60.184 90.762 522g.111070667 0.033 30.033 1 1.033 90.032 30.926 323g.1110
24、71064 0.216 70.220 6 1.280 00.194 80.887 124g.111071109 0.116 70.110 8 1.123 40.103 80.658 125g.111071125 0.116 70.110 8 1.123 40.103 80.658 126g.111071133 0.116 70.110 8 1.123 40.103 80.658 127g.111071181 0.016 70.016 7 1.016 80.016 31.000 028g.111071193 0.200 00.207 8 1.259 60.184 90.762 529g.1110
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