麦红吸浆虫热激蛋白基因SmHsp60的分子特征及功能研究.pdf
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1、麦红吸浆虫 是重要的农业害虫滞育使其度过夏季和冬季的极端环境 本研究旨在探析麦红吸浆虫滞育进程中热激蛋白()基因表达与滞育发育及温度耐受性之间的关系【方法】采用 和 技术克隆麦红吸浆虫 全长序列并进行生物信息学分析采用 技术检测 在麦红吸浆虫滞育前至滞育后发育不同阶段(滞育前、滞育、滞育后静息和滞育后发育)幼虫及越夏幼虫在极端高温 和 水浴中处理 以及 水浴中(对照)和 和越冬幼虫在极端低温 和 处理 以及 处理(对照)和 胁迫下的表达量通过原核表达和亲和柱层析技术获得 重组蛋白采用比色法和 法测定重组蛋白 抑制苹果酸脱氢酶()下热聚集的能力【结果】获得麦红吸浆虫 (登录号:)全长序列长 开放
2、阅读框长 编码 个氨基酸编码蛋白的相对分子量为.氨基酸序列分析表明 具有线粒体 典型的标签序列与同为瘿蚊科()的甘蓝瘿蚊 序列一致性最高、亲缘关系最近 检测结果表明麦红吸浆虫 在滞育阶段表达量没有显著变化但在滞育后静息阶段逐渐升高在滞育后静息阶段早中期即 月和翌年 月达到最高显著高于在其他发育阶段的 与未处理的对照相比 和 下 以及 下 时可显著诱导越夏幼虫 上调表达 下 可显著诱导越冬幼虫 上调表达但高于 和低于 的表达量没有显著变化 获得了高纯度的 重组蛋白可有效保护 免遭热聚沉具有显著的分子伴侣功能【结论】参与麦红吸浆虫滞育调控可能与滞育终止及滞育期间的耐热和耐寒性相关关键词:麦红吸浆虫
3、 滞育 温度胁迫 基因表达 分子伴侣中图分类号:文献标识码:文章编号:()(:)(.)昆虫学报 卷:【】.().【】.().()().().【】(:).().(.).【】.:麦红吸浆虫 是世界小麦主产区的重要害虫(.)同时是一种典型的专性滞育昆虫 该虫以幼虫潜伏在小麦颖壳内吸食灌浆期籽粒汁液造成麦粒瘪瘦、空壳或霉烂幼虫老熟后落到地面、钻入土中结茧进入滞育直到翌年 月小麦拔节后从茧中出来恢复发育、化蛹和羽化(王越等 .)即滞育不仅使麦红吸浆虫生长发育与小麦物候协调一致同时帮助其度过夏季和冬季的极端环境 由于滞育在麦红吸浆虫种群延续和繁衍中的重要作用深入理解其滞育机理非常必要热激蛋白()是机体在应
4、激情况下能够大量合成的一类高度保守蛋白质该类蛋白在生物体内普遍存在作为分子伴侣协助细胞内多肽转运和折叠帮助受损蛋白修复和降解在维持细胞生存和内环境稳定中起着重要作用 依据分子 量 大 小 和 序 列 同 源 性 分 为 和小分子()个家族(.)是一类依赖 的分子伴侣与大肠杆菌 伴侣蛋白 高度同源(.)在 期马 倩等:麦红吸浆虫热激蛋白基因 的分子特征及功能研究 生物抵御极端温度(.)、重金属(.)和高盐(.)等胁迫以及疾病免疫中(.)发挥重要作用近些年的研究发现 的表达不仅与环境胁迫相关与昆虫滞育也密切相关但其在滞育中的作用因其家族和昆虫种类不同而有大的差别 例如红尾肉蝇 和 在进入滞育后上调
5、整个滞育期表达量显著高于滞育前和恢复发育后与滞育维持和滞育期间的抗寒性有关但 在进入滞育后下调滞育终止后表达升高(.)与之不同竹蠹螟 进入滞育后 上调表达(.)丝光绿蝇 中 表达与滞育关系不大(.)目前 与昆虫滞育关系的研究主要集中在 和(.司风玲等)作为一个重要的 家族其与滞育的关系仅在二化螟(.)、梨小食心虫(.)和豚草卷蛾(.)等少数昆虫中涉及为全面了解昆虫滞育机理阐释 在昆虫滞育中的作用应对更多昆虫 进行研究本研究利用 和 技术克隆麦红吸浆虫 全长序列利用 技术分析 在麦红吸浆虫滞育前后及滞育期不同阶段幼虫及越夏/越冬幼虫在短期极端温度胁迫下的表达模式并通过原核表达诱导技术和苹果酸脱氢
6、酶()热聚集试验研究 重组蛋白的分子伴侣活性为探析 与麦红吸浆虫滞育发育及温度耐受性之间的关系提供理论依据 材料与方法.供试昆虫本研究所用的麦红吸浆虫幼虫均采自田间参考刘禹含等()等的方法收集 年 月 日在陕西省兴平市大量采集麦红吸浆虫幼虫严重危害的麦穗取少量剥穗获得滞育前 龄幼虫其余麦穗置于在西北农林科技大学校园构建的养虫圃()适量浇水促使幼虫脱离麦穗和钻入土中 月 日收集幼虫作为滞育前幼虫 月下旬大部分幼虫结茧进入滞育后至次年 月每月 日定期淘土采集圆茧 月每月收集的作为滞育幼虫前期研究表明 月后采集的结茧幼虫转入高温后几乎全部能恢复发育说明此后采集的幼虫已打破滞育进入滞育后静息期(.)月
7、至次年 月每月收集的为滞育后静息幼虫 月中旬幼虫离开茧恢复活动后淘土采集滞育后发育幼虫 收集的幼虫每 头装于 冻存管中作为 个生物学重复每次至少收集 个生物学重复用于基因克隆和滞育进程中表达模式分析 月和 月每次至少多收集 个重复用于高、低温胁迫下的表达分析样品收集或温度胁迫后液氮速冻 保存.麦红吸浆虫 的克隆取.节收集的麦红吸浆虫滞育前幼虫 头加入裂解液冰上研磨后按照 (北京)说明提取总 依据 ()(大连)说明书合成 第 链 根据前期获得的麦红吸浆虫幼虫转录组 中 的 序 列 利 用 .软件设计 和 特异引物(表)按照 和 (大连)说明书分别进行 和 末端序列扩增 产物送测序 应用 .软件将
8、得到的 和末端序列与转录组中的序列拼接根据拼接获得的全长序列设计引物(表)以合成的 为模板进行 扩增 反应体系():模板 正反向引物(/)各 扩增程序:个循环最后 延伸 产物送测序.生物信息学分析通过在线服务工具 (:./.)查找 的开放阅读框应用 数据库的 工具(:./)进行编码蛋白理化性质分析 应用 工 具(:./.)进行蛋白功能域鉴定以人 的 为模板(:.)应 用 软件(:.)进行蛋白质三维结构模拟利用 软件对构建 昆虫学报 卷的蛋白质三维结构进行可视化编辑 应用 软件(:./.)对 与来自于双翅目、鞘翅目和鳞翅目的 种昆虫 的氨基酸序列进行相似性分析采用.软件中的邻接法()构建系统发育
9、树 检验设置为 次重复.麦红吸浆虫 在滞育前至滞育后发育幼虫中的表达量检测取.节收集的麦红吸浆虫滞育前至滞育后发育不同阶段幼虫各 头按照.节的方法提取总 并反转录成 根据.节克隆得到的 和内参基因 (登录号:)序列设计实时定量 用引物(表)以获得的各阶段幼虫 为模板在 ()上进行 反应体系():(北京)正反向引物(/)各.模板 超纯水.反应程序:共 个循环最后 开始每循环增加.后停留 次循环探测产物的熔解曲线 每处理重复 次.极端高、低温胁迫后麦红吸浆虫幼虫中 表达量的检测麦红吸浆虫主要在土壤 下滞育陕西关中这个范围夏季最高、冬季最低温度分别在 和 左右而夏季地面极端温度常超过 冬季达 为明确
10、 对地面极端高、低温胁迫的响应将 年 月份采集的新鲜麦红吸浆虫越夏幼虫每 头放入 离心管分别在 和 水浴中处理 (以从田间土壤直接收集的未处理的幼虫为对照)以及 水浴中处理(对照)和 将同年 月采集的结茧越冬幼虫在低温培养箱中分别进行 和 处理 (以从田间土壤直接收集的未处理的幼虫为对照)以及 处理(对照)和 每处理重复 次 按照.节的方法提取高、低温处理和对照幼虫的总 并反转录成 以合成的 为模板进行 分析所用引物、反应体系和程序同.节表 本研究所用引物序列 引物引物序列()用途全长验证 ()原核表达()下划线序列 和 分别为 和 的酶切位点 .麦红吸浆虫 蛋白的表达与纯化通过 软件设计含有
11、限制性内切酶和 酶切位点的特异性引物(表)通过 扩增 的编码区序列扩增产物克隆至 载体转化大肠杆菌 感受态细胞 后 测 序 将/重 组 质 粒 与()表达载体分别用相同内切酶双酶切产物用 连接酶(长沙)连接后转入大肠杆菌 感 受 态 细 胞 并 测 序 ()/重组质粒菌液转入原核表达用大肠杆菌感受态细胞()测序验证后的阳性克隆菌液按 (/)的比例接于含 /卡那霉素的 液体培养基 /下震荡培养当达到.时加入终浓度为./期马 倩等:麦红吸浆虫热激蛋白基因 的分子特征及功能研究 的 诱导 后离心弃上清菌体用 缓冲液悬浮溶菌酶裂解液氮反复冻融 次后离心 检测上清和沉淀中蛋白的表达 不可溶的蛋白用 /尿
12、素变性、复性后用 (上海)纯化(.)纯化后的蛋白采用 蛋白定量测试盒(北京)检测浓度.苹果酸脱氢酶()热聚沉实验通过苹果酸脱氢酶()(美国)热聚沉实验分析 蛋白是否具有分子伴侣活性采用比色法(.)和 电泳(王婵)两种方法检测 用(.)缓冲液将、牛血清蛋白()和重组蛋白 分别稀释为/设对照组 处理组 蛋白和阴性对照组 组各组置于 多功能酶标仪(瑞士)中检测 内 处吸光值的变化 重复 次 前两组在 金属浴中孵育 然后 /离心 得到的上清和沉淀进行 分析.数据分析采用 算法()计算各处理幼虫 相对表达量 应用 软件 对 处 理 间 的 差 异 进 行 单 因 素 方 差 分 析()和 氏多重比较 结
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- 吸浆虫 蛋白 基因 SmHsp60 分子 特征 功能 研究
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