金龟子绿僵菌固态发酵条件的响应面优化研究.pdf
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1、金龟子绿僵菌固态发酵条件的响应面优化研究尼玛扎西1,4王壮壮2黄 玉3张国强3刘国一*1(1.西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所西藏拉萨8500002.西藏自治区农牧科学院水产科学研究所西藏拉萨8500003.安徽工程大学生物与化学工程学院安徽芜湖2410004.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室西藏拉萨850000)摘要金龟子绿僵菌是绿色环保型生物杀虫剂之一,它能侵染多种害虫,且不易产生抗药性,在环境中具有较高的持久性,但在实际生产中所需发酵成本较高。该研究通过单因素试验探究了培养基质、添加剂等营养条件,pH值、接种量等培养条件及其对金龟子绿僵菌的生长及产孢的影响,在此
2、基础上,采用响应面法评价了玉米粉与稻壳质量比、维生素B1添加量、CaCO3添加量和含水量等对金龟子绿僵菌固态发酵条件的影响,确定适合绿僵菌产孢的最佳培养基配方。结果表明,通过单因素和响应面确定的最佳培养基配方为:玉米粉与稻壳质量比为 1.79:1、维生素 B1 添加量 0.04%、CaCO3添加量 0.09%、含水量为59.25%、pH为6、接种量6%,理论产孢量为1.24109个孢子/g,实际得到产孢量为1.20109个孢子/g,对4个因素3个水平进行回归分析,拟合度为96.14%,表明优化模型可靠。关键词金龟子绿僵菌;固态发酵;产孢量;响应面;优化DOI:10.16249/ki.2096-
3、4617.2023.02.001中图分类号 TQ453.5文献标识码 A文章编号 2096-4617(2023)02-001-009收稿日期:2022-11-26基金项目:高原生物有机肥应用与示范项目(Y20X20195400004790).第一作者简介:尼玛扎西,男,藏族,西藏拉萨人,西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所副研究员,主要研究方向为资源与环境生物技术。通讯作者简介:刘国一,男,汉族,贵州黔南人,西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所研究员,主要研究方向为土壤耕作、废弃物资源化利用。引 言金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一种广谱的昆虫病原真菌,具
4、有不污染环境、无残留、对人畜无害等优点,被认为是具有开发潜力的环境友好型杀虫剂。它通过附着在昆虫体表并分泌大量酶类酶解昆虫体表角质层中的蛋白质等,侵入到昆虫的淋巴系统,利用昆虫的营养物质生长发育,同时分泌毒素,导致昆虫死亡1-3。金龟子绿僵菌作为一种环保且有效的生物杀虫剂,在防治虫害方面可起到重要作用。化学杀虫剂不仅会污染环境,而且害虫易产生抗药性,但昆虫病原真菌能够提高长久的防治效果4,因此,生物杀虫剂昆虫病原真菌在市场中的前景越来越好。目前绿僵菌的生产主要是通过液固两相发酵方式进行发酵,固态发酵相对于液态深层发酵,所需的发酵培养基更简单,水的消耗少且废水产生少,不需要严格控制发酵参数,容易
5、控制细菌污染5。但在实际生产中发酵成本较高,限制了绿僵菌在市场中的推广及应用6。响应面法是一种用于优化试验条件的数学统计方法,具有试验次数少、精度高等优点,在应用于优化发酵培养基、培养条件等方面取得了较好的效果7。张琪等8利用响应面法得到最优培养基配方为:蔗糖20.07 g/L、酵母膏20.04 g/L、MgSO40.70 g/L,验证金龟子绿僵菌生物量达16.523 g/L,较优化前提高了37.24%。本研究从大米、玉米粉等低廉易得的农副产物中筛选最佳底物,设计单因素和响应面试验,旨在充分利用农副产品资源,优化相关工艺参数,确定最佳底物配方和培养条件来提高生产效率,从而降低生产成本,以进一步
6、提高产孢量。1 材料与方法1.1 实验材料金龟子绿僵菌AU34为本实验室保藏的菌株;大米、玉米粉、米糠、稻壳为市售。1.2 培养基与试剂种子培养基:PDA液体培养基(土豆 200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL);固态培养基:大米、米糠、玉米粉3种培养基质,稻壳为载体;0.05%Tween 80溶液:取50 L Tween 80溶于100 mL水中。1.3 实验仪器HSP-70BE恒温恒湿培养箱(上海力辰邦西仪器科技有限公司);XSP-2CA光学显微镜(上海长方光学仪器有限公司);SW-CJ-2FD双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);ZQZY-78BN双层振荡培养箱(上海知楚仪
7、器有限公司)。1.4 实验方法1.4.1 种子孢悬液的制备取5 mL 0.05%的Tween 80溶液打在新鲜的种子培养基平板上,将孢子冲洗下来放入到含有玻璃珠的10 mL离心管中,充分振荡均匀后,用四层灭菌擦镜纸进行过滤,稀释后在光学显微镜下计数,将孢子悬液的浓度调整至107个孢子/mL左右。接种于PDA液体培养基,28、200 rpm振荡培养48 h。1.4.2 产孢量的计数培养5 d后,称取适量样品,烘干后,取定量样品置于装有 0.05%的Tween 80溶液和玻璃珠的250 mL锥形瓶中,200 rpm振荡至孢子完全散开后,在光学显微镜下进行计数,计算孢子量。1.4.3 单因素试验设计
8、(1)固态发酵基质的确定参考吴盼盼等相关研究9-15,基础培养基中基质与稻壳的质量比定为1:1、pH为7.0、接种量为2%、含水量为50%,更换培养基质大米、米糠、玉米粉,测定绿僵菌的生长及产孢情况来确定最佳发酵基质。(2)维生素种类的确定在确定底物的基础上添加维生素,以0.02%为最初维生素添加量,变换维生素种类(维生素C、维生素B1、维生素B6),培养后计算产孢量。(3)添加剂种类的确定在确定底物和维生素的条件上加入添加剂,以0.04%为最初添加剂添加量,变换添加剂种类(CaCO3、CuSO4、MgSO4),测定培养后的产孢量。(4)基质与稻壳质量比、维生素及添加剂添加量的确定在确定发酵基
9、质,维生素和添加剂的基础培养基上,分别设定基质与稻壳的质量配比(3:1、2.5:1、2:1、高原科学研究 2023年第2期(总第23期)221.5:1、1:1),维生素添加量(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)和添加剂的添加量(0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%),把产孢量作为指标,确定最佳含量。(5)含水量、接种量及pH的确定在确定发酵基质,维生素和添加剂的基础培养基上,分别在含水量(50%、60%、70%、80%、90%),接种量(2%、6%、8%、10%、20%)和pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的条件下,测定绿僵菌的产孢量
10、,确定最佳培养条件。1.4.4 响应面试验设计在单因素试验中选取4个因素3个水平来进行响应面试验设计,以确定最佳培养基配方。1.4.5 数据处理所有数据均重复3次,利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和方差分析,通过Origin 2018作图。2 结果分析2.1 不同培养基质及比例对绿僵菌产孢量的影响以大米、玉米粉、米糠为底物,分别与稻壳以1:1的质量比进行绿僵菌发酵,培养5 d后,计算绿僵菌的产孢量,从表1可以看出玉米粉作为基质时产孢较好,米糠次之,大米的产孢量最低。玉米粉与稻壳的不同质量比对绿僵菌的产孢量影响由图1所示。玉米粉质量占比较多时容易结块,使得通气环境
11、变差,分生孢子产量减少。当玉米粉与稻壳的质量比由3:1、2.5:1到2:1时,产孢量逐渐提高。随着玉米粉质量的减少和稻壳质量的增加,绿僵菌的分生孢子产量下降。底物减少,绿僵菌发酵所需要的营养减少。虽然稻壳的质量增加提高了通气量,但无法满足绿僵菌的生长需要,从而绿僵菌的产孢能力下降。因此,选择适宜的质量比有利于绿僵菌产孢,当玉米粉与稻壳的质量比为2:1时,产孢量最高,为最佳质量比。表1 不同培养基质对绿僵菌产孢量的影响Tab.1 Effects of different culture substrates on sporulation of Metarhizium anisopliae培养基质
12、产孢量(108个孢子/g)大米4.230.51b玉米粉6.420.31a米糠4.970.47b注:同行数据后不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters after peer data indicate significant difference(P0.05).2.2 不同维生素及含量对绿僵菌产孢量的影响维生素是许多辅酶的成分,对代谢具有重要的调节成分。维生素还可以为真菌生长提供保护19,而且能增强其对紫外辐射的耐受能力20。当添加维生素C、维生素B1、维生素B6于发酵培养基中后,这3种维生素都能提高其产孢能力,其中维生素B1对绿
13、僵菌的产孢影响最大(表2)。绿僵菌的分生孢子产量随着维生素B1含量的增加呈先上升再下降的趋势(图2),当维生素B1含量为0.04%时,产孢量达到最高,为最适添加量。图1 玉米粉与稻壳的质量比对绿僵菌产孢量的影响Fig.1 Effect of quality ratio of corn powder andrice hull on sporulation of Metarhizium anisopliae注:不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).尼玛
14、扎西,王壮壮,黄玉,等:金龟子绿僵菌固态发酵条件的响应面优化研究33表2 不同维生素对绿僵菌产孢量的影响Tab.2 Effects of different vitamins on sporulation of Metarhizium anisopliae维生素产孢量(108个孢子/g)维生素C6.740.34b维生素B17.430.26a维生素B66.530.18b注:同行数据后不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters after peer data indicate significant difference(P0.05)
15、.2.3 不同添加剂及含量对绿僵菌产孢量的影响在发酵培养基中添加一些添加剂可提高真菌的活力和产孢量21。由表3可知,在CaCO3、CuSO4、MgSO4这3种添加剂中,添加CaCO3于发酵培养基中得到最高产孢量,MgSO4次之,而CuSO4却抑制了绿僵菌的生长及产孢,因此选择CaCO3为适宜的添加剂。研究表明,添加CaCO3在谷物培养基中可以防止谷物粘在一起,增加真菌生长的表面积22。随着CaCO3添加量增加,分生孢子产量也增加,当CaCO3添加量为0.10%时,绿僵菌的产孢量为8.65108个孢子/g;随着CaCO3添加量继续增加,产孢量开始下降,因此,CaCO3的最佳添加量为0.10%(图
16、3)。表3 不同添加剂对绿僵菌产孢量的影响Tab.3 Effects of different additives on sporulation of Metarhizium anisopliae添加剂产孢量(108个孢子/g)CaCO38.100.18aCuSO46.420.10bMgSO47.730.25a注:同行数据后不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters after peer data indicate significant difference(P0.05).图2 维生素B1的添加量对绿僵菌产孢量的影响Fig.2
17、Effect of vitamin B1 addition on sporulationof Metarhizium anisopliae注:不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).图3 CaCO3的添加量对绿僵菌产孢量的影响Fig.3 Effect of CaCO3addition on sporulationof Metarhizium anisopliae注:不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowerca
18、se letters indicate significant difference(P0.05).2.4 不同含水量对绿僵菌产孢量的影响含水量对绿僵菌的产孢影响很大,湿度较低阻碍养分扩散,影响微生物的生长23。高湿度环境促进孢子萌发,但湿度过高会导致培养基质的物理性状和几何结构发生改变,如玉米粉会结块,抑制氧的传输,进而影响到绿僵菌的产孢性能。从图4可以看出,含水量为60%时,分生孢子产量为9.48108个孢子/g,达到最高产量;当含水量再继续增加,产孢量逐渐下降,说明含水量过多不利于绿僵菌的产孢,故60%的含水量最适宜绿僵菌产孢。2.5 不同接种量对绿僵菌产孢量的影响接种量决定菌体在发酵培
19、养基中的生长速度,接种量大可以缩短菌体繁殖达到高峰的时间,使产物的形成提前到来,并可以减少杂菌的生长机会。若接种量过小,发酵时间延长并可能增加成本,同时可能会降低发酵效率24。在培养基中接种2%、6%、8%、10%、20%的绿僵菌孢子悬液培养后,其对绿僵菌的产孢影响见图5。接种量为6%时,孢子产量为8.67108个孢子/g,此时产孢效果较好;当接种量逐渐增加至高原科学研究 2023年第2期(总第23期)448%、10%、20%时,分生孢子产量逐渐降低;当进行大量接种时,发酵培养基中的底物不足,难以满足菌体生长的需求,产孢量逐渐减少,最终选择6%的接种量为宜。注:不同小写字母表示差异显著(P0.
20、05)。Notes:Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).图4 不同含水量对绿僵菌产孢量的影响Fig.4 Effect of different water contenton sporulation of Metarhizium anisopliae注:不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).图5 不同接种量对绿僵菌产孢量的影响Fig.5 Effect
21、of different inoculation rateson sporulation of Metarhizium anisopliae2.6 不同pH对绿僵菌产孢量的影响昆虫病原真菌的杀虫机制在很大程度上取决于真菌分泌的酶类,而这些酶类受pH影响比较大,在适宜的pH范围内才能发挥作用25。丝状真菌一般能够在pH为29的范围内生长,在发酵培养基的pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时,发现金龟子绿僵菌在pH为6.5时生长较好,产孢表现较好(图6)。因此,选用pH为6.5时作为最适pH值。2.7 绿僵菌发酵条件响应面试验设计2.7.1 响应面优化因素与水平设计通过单因素试验获得的结果
22、选取玉米粉与稻壳质量比、维生素B1添加量、CaCO3添加量和含水量4个因素进行响应面试验设计,结果见表4。表4 因素水平表Tab.4 Factor levels水平-101因素A:玉米粉:稻壳质量比2.512.011.51B:维生素B1添加量(%)0.020.040.06C:CaCO3添加量(%)0.080.100.12D:含水量(%)5060702.7.2 响应面试验结果及分析通过4个因素3个水平29组实验获得的结果和回归模型分析见表5和表6。通过Design Expert 8.0.6软件对表5中的数据进行回归分析,得到以产孢量为响应值(Y)与玉米粉与稻壳质量比(A)、维生素B1添加量(B)
23、、CaCO3添加量(C)和含水量(D)之间关联的回归方程式为:Y=11.99-1.74A+0.023B-0.38C-0.48D+0.71AB+0.33AC-0.045AD+0.94BC-0.058BD-0.56CD-2.40A2-1.19B2-1.05C2-1.73D2从表6方差分析结果可以看出,模型整体P0.05,为不尼玛扎西,王壮壮,黄玉,等:金龟子绿僵菌固态发酵条件的响应面优化研究注:不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Notes:Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).图6 不同pH值对绿
24、僵菌产孢量的影响Fig.6 Effects of different pH values on sporulationof Metarhizium anisopliae55显著,决定系数R2=0.9501,校正系数R2=0.9002,拟合程度良好,表明整个模型可行。在比较每个因素的方差分析时发现,玉米粉与稻壳质量比的一次项及二次项、维生素B1添加量的二次项、CaCO3添加量的二次项、含水量的二次项的P值均小于0.01,说明对产孢量的影响极显著;CaCO3添加量、含水量、玉米粉与稻壳的质量比与维生素B1添加量、维生素B1添加量与CaCO3添加量的P值均小于0.05,说明影响显著。表5 响应面优化
25、试验设计及结果Tab.5 Response surface optimization experimental design and results试验号1234567891011121314151617181920212223242526272829A01000-11100000-1010-100-10-100-1011B11-10000-10-11-1-11000010-110000000C0011-10000-100001000100-1-1001-11-1D-10011110001-110-1-10-100000000-100产孢量(108个孢子/g)9.130.497.560.618
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