全内反射荧光显微术在G蛋白偶联受体研究中的应用.pdf
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1、第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ,文章编号:()全内反射荧光显微术在 蛋白偶联受体研究中的应用方三华,杨 丹,刘 丽,肖桂凤(浙江大学医学院公共技术平台,浙江 杭州)摘 要 蛋白偶联受体是最大的细胞膜受体超家族,是许多临床治疗药物的靶点。放射性配体结合、酶联免疫吸附和免疫共沉淀是研究它们结构和功能的主要技术,但这些属于群体平均()研究,无法得到单个分子图像和动态变化。全内反射荧光显微镜利用隐逝波激发临界面下 范围内荧光物质成像,具有信噪比高、轴分辨率高、速度快和对生物样本损伤小等优点,是常用的单分子荧光成像技术。本文在介绍全内反射荧光显微镜发展历史、原理、组成和成像优势的基础上,
2、详细阐述全内反射荧光显微镜在研究 蛋白偶联受体构象变化、寡聚化、内吞和再循环以及信号转导等方面的应用,并提出未来展望。关键词 全内反射原理;荧光显微镜;蛋白偶联受体;应用中图分类号:;文献标识码:收稿日期:;修订日期:基金项目:浙江省基础公益研究计划();浙江大学实验技术研究项目()作者简介:方三华(),男(汉族),浙江杭州人,高级实验师:蛋白偶联受体(,)是最大的细胞膜受体超家族,目前已有 多种得到确认。参与生物体内大部分的生理活动和信号调节,其功能失调会导致多种疾病的产生,如心脑血管疾病、代谢疾病、神经相关性疾病、炎症、免疫性疾病以及癌症等。是重要的药物靶点之一,其相关药物占上市药物的。因
3、此,深入研究 的结构和功能,对于探索 相关疾病的治疗新靶点和研发新药物具有重要意义。由一条单一多肽链组成,包含一段胞外氨基末端(端)、七个螺旋形成的跨膜结构域和一个胞内的羧基末端(端),它通过与 结合蛋白(蛋白)偶联调节胞内相关酶的活性,以此产生第二信使而将配体信号从胞外跨膜传递到胞内,使细胞的功能活性发生改变。以往主要采取放射性配体结合、酶联免疫吸附、免疫共沉淀等技术研究 结构和功能,这些技术都是把不同状态、不同构象分子的反应加以平均,属于群体平均()研究,无法为受体分子激活的具体过程提供直接实验证据,无法得到单个分子图像和动态变化,而单分子光学成像技术可以克服群体平均研究的缺点,凭借其较高
4、的时空分辨率,直接观察 单体或二聚体状态、内化以及分子间相互作用,获取的机制更加接近真实情况。单分子光学成像技术主要有全内反射荧光显微 技 术(,)、受 激 发 射 损 耗(,)显微技术、随机光学重建显微术(,)、结 构 光 照 明 显 微 技 术(,)等。技术是一种新型光学显微成像技术,是常用的单分子成像技术,该技术利用光发生全内反射时产生的隐逝波照明样本,使照明区域限定在样品表面薄层范围内,有效控制了激发体积,具有其它光学显微成像技术无法比拟的高信噪比和对比度,因此,广泛用于细胞膜蛋白包括 蛋白偶联受体的结构和动力学研究。本文将简要介绍 成像的发展历史、基本原理、组成和成像优势,重点阐述
5、成像在 蛋白偶联受体研究中的应用以及未来展望。成像概况 历史 年,等介绍了一种新的显微镜光学系统,该系统的照明来源于水 玻璃界面的全内发射,但由于光学系统对比度非常低,没能获取光学图像。年,等首次利用全内反射的原理观测溶液里单个分子的荧光。世纪 电子显微学报 第 卷 年代,密西根大学的生物物理学家 将 的全内反射技术应用于荧光显微镜,搭建了棱 镜 型 全 内 反 射 荧 光 显 微 镜(,),详细描述了 技术,并应用于细胞生物和化学动力学研究。世纪 年代,随着新型物镜、聚光镜和超灵敏探测器的出现,技术才得到充分发展,并逐步用于单分子研究。年,实验室利用 技术首次观察到了溶液中荧光标记着的单个蛋
6、白质分子。而后广泛用于细胞膜相关分子的结构和动力学研究。原理和组成 是将光的全反射理论和荧光成像技术相结合而建立的一种宽场显微镜,其基本原理是入射光线从光密介质进入光疏介质时,会发生折射和反射。当入射角大于临界角时,光线在临界面被全部反射,即发生了全内反射(图)。由于光的波粒二象性效应,部分光的能量会透过临界面渗透到光疏介质中,这一部分透过的能量场称之为“隐逝波”。隐逝波强度随临界面的垂直距离呈指数衰减,它仅激发紧贴临界面薄层范围内()的荧光基团,而更深层荧光基团不被激发(图)。大多数 系统使用激光束作为入射光,主要有棱镜型(图)和物镜型(图)两种类型。棱镜型 优势是系统相对简单,成本较低,信
7、噪比相对较高;劣势是放置样品的空间受到棱镜的限制,不利于研究活细胞、组织等样本。物镜型 优势是样本放置方便,可与多种技术联用;其劣势是需使用高数值孔径物镜,成本相对高。目前多数 系统为物镜型,物镜型 系统主要由激光器、全内反射照明器、物镜、光电探测器和软件组成。成像优势 相比于激光共聚焦显微镜,具有如下优势,:()隐逝波照明区域限定在样品表面 厚的薄层范围内,有效控制了激发体积,故信噪比和对比度高,轴方向分辨率高,达纳米水平,可检测单分子;()使用面阵式检测器,非点扫描成像,故成像速度快,可用于活细胞分子运动检测;()隐逝波能量低,激发范围小,对生物样本本身的损伤小,故适合生理条件下实时观测生
8、物样本。与、和 超分辨显微技术相比,的分辨率略差一些,但具有成像速度快和对生物样本损伤小的优点;与电子显微镜(,)相比,不需要对样本进行固化和导电性处理,不会改变或破坏样品的微观结构,能对活体生物样品进行实时观测,具有样品制备简单、生理条件下实时观测生物样本等优点。鉴于这些特点,能实现对样本实时、快速、高分辨和高信噪比探测,因此,广泛用于细胞膜蛋白包括 蛋白偶联受体的结构和动力学研究。成像在 蛋白偶联受体研究中应用 蛋白偶联受体的荧光标记 作为一种特殊的宽场显微成像方法,具备良好的空间和时间分辨率,可在活细胞实时观察和跟踪数百甚至数千个单个分子。为了在细胞表面显示,受体必须用荧光团标记,荧光团
9、需有相当程度抗猝灭 光漂白特性,并具有显著的量子产率。目前,中用于研究 蛋白偶联受体的荧光标记方法主要有两类,第一类是用荧光有机染料标记;第二类是使用基因工程方法构建融合蛋白。荧光染料标记有两种方式,一种是荧光染料直接耦合受体,美国斯克利普斯研究所学者在 肾上腺素能受体的跨膜螺旋 末端用 荧光探针进行位点特异性标记,该位点荧光团强度变化可反映受体构象转变,因此,利用全内反射荧光显微镜观察单个受体分子荧光变化,可检测受体构象变化。实验可在不存在配体的情况下进行,揭示受体的自发构象转变,或者用激动剂或反向激动剂揭示配体如何改变受体的动力学以刺激或抑制受体信号。另一种方式是构建荧光染料配体,利用配体
10、和受体结合形成复合物间接检测受体的分布和运动,英国国家医学研究所 等利用荧光染料(或)标记的配体结合 毒蕈碱受体,在 下,以 或 帧 秒的速率记录活细胞的 毒蕈碱受体的位置和强度,结果显示细胞基底质膜分布许多移动的荧光点,这些移动的荧光点可被受体拮抗剂完全阻断,提示荧光配体对受体特异性标记,荧光点代表受体单体或聚集体。第二类基因工程方法是将荧光蛋白或其他标签蛋白插入或结合到 蛋白偶联受体构建融合蛋白,常用有、融合蛋白或 标签技术。等构建代谢性谷氨酸受体 融合蛋白(),用 观察和检测 的表达和功能,他们发现质膜 聚集在不同的区域,其大小和初始时空聚集水平决定了 第 期方三华等:全内反射荧光显微术
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