基于PI3K_Akt信号通路探讨“赤芍-附片”对肝细胞炎症损伤的影响.pdf
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1、 2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 965DOI:10.13463/ki.jlzyy.2023.08.023基于 PI3K/Akt 信号通路探讨“赤芍-附片”对肝细胞炎症损伤的影响唐陈琴,谭年花,曹钰楠,杜 珊,陈 斌*(湖南中医药大学第一附属医院肝病科,长沙 410007)摘要:目的 基于磷脂酰激醇 3 激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB 又称 Akt)信号通路,探讨“赤芍-
2、附片”对肝细胞炎症损伤的保护作用。方法 体外培育 L02 细胞株,设立正常组、模型组、空白血浆组、“赤芍-附片”组、Copanlisib(PI3K 抑制剂)组,采用 D-半乳糖联合脂多糖干预构建肝细胞炎症损伤模型。通过 CCK-8 法筛选含药血浆最佳干预浓度及时间;透射电镜观察细胞超微结构;ELISA 法检测白介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)表达水平;实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,RT-q PCR)、蛋白免疫
3、印迹法(Western blot)测定 PI3K/Akt 通路 mRNA 及蛋白表达水平。结果 较之正常组,模型组受损细胞器及自噬体数量增加,IL-1、IL-6、TNF-含量显著升高(P0.01),PI3K、Akt mRNA及磷酸化蛋白表达水平明显降低(P0.01)。较之模型组,“赤芍-附片”组细胞形态相对正常且自噬体数量减少,IL-1、IL-6、TNF-含量显著下降(P 0.01),PI3K、Akt mRNA 及磷酸化蛋白表达上调(P 0.01 或P 0.05)。结论“赤芍-附片”药对可能通过调控PI3K/Akt信号通路,减少IL-1、IL-6、TNF-分泌,从而减轻D-半乳糖联合脂多糖诱导
4、的肝细胞损伤。关键词:赤芍;附片;含药血浆;L02 细胞;PI3K/Akt 信号通路 中图分类号:R256.4 文献标志码:A 文章编号:1003-5699(2023)08-0965-05Effects of the couplet medicines of peony root and prepared common monkshood branched root on the inflammatory damage of hepatocytes based on the PI3K/Akt signaling pathwayTANG Chenqin,TAN Nianhua,CAO Yunan
5、,DU Shan,CHEN Bin*(Department of Hepatology,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410007,China)Abstract:Objective To explore the protective effect of the couplet medicines of peony root and prepared common monkshood branched root on the inflammatory damage of
6、 hepatocytes based on the phosphati-dylinositol 3-kinase(PI3K)/protein kinase B(PKB,also known as Akt)signaling pathway.Methods L02 cell strains were cultured in vitro,and a normal group,a model group,a blank plasma group,a medicine group(peony root-prepared common monkshood branched root)and a Copa
7、nlisib(PI3K inhibitor)group were established.D-galactose combined with lipopolysaccharide were used to intervene in the establishment of a hepatocyte inflammatory injury model,and corresponding interventions were given respectively.The optimal intervention concentration and time of drugs were screen
8、ed through the CCK-8 method.The ultrastructure of cells was observed by transmission electron microscope.基金项目:湖南省卫生健康委科研课题(202103081452);湖南省高层次卫生人才“225”工程学科带头人培养项目(湘卫函2019196 号);湖南省研究生科研创新项目(20210731)作者简介:唐陈琴(1998),女,硕士研究生,主要从事中医药防治肝病研究*通信作者:陈 斌,电子信箱-方药纵横966 2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Ch
9、inese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是一组由慢性肝病发展而来的急危重症,临床以严重黄疸和凝血功能障碍为特征1。其发病机制非常复杂,目前普遍认为,持续性炎症反应与免疫失衡是 ACLF 发生发展的关键环节2,大量肝细胞坏死是ACLF 发展过程中的主要事件,肝小叶坏死炎症活动程度是 ACLF 患者短期病死率的临床独立组织学预测因素3。课题组所在学科基于长期实践,总结出 ACLF患者湿热、脾虚、瘀毒相互夹杂的中医证候学特征,并据此提出肝衰竭“阳黄-阴阳黄-阴黄”辨证模式以及“清温
10、并用”的中医治法,临床疗效确切且安全性较好4。赤芍、附片分别起凉血化瘀解毒、温阳健脾之功,是清温并用法的核心药物,可通过抑制炎症反应、利胆退黄、调节免疫等方式有效拮抗肝衰竭5,但赤芍、附片伍用减轻肝细胞损伤的具体作用机制尚需进一步研究。磷脂酰激醇 3 激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(proteinki-naseB,PKB 又称 Akt)信号通路广泛存在于肝脏中,调控细胞自噬、迁移、增殖等6,在ACLF的疾病进展中发挥重要作用。因此,本研究借助肝细胞炎症损伤模型,探讨 PI3K/Akt 信号通路是否为“赤芍-附片”减轻肝细胞炎症损伤的
11、潜在靶点,以促进该药对的临床应用。1 材料与方法1.1 动 物 及 细 胞 雄 性 SPF 级 SD 大 鼠,购 自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(合格证号:ZS-202107130005)。实验开展于湖南中医药大学实验中心,经校伦理委员会批准(批准号 LLBH-202103160007)。正常人肝细胞株 L02 细胞,购自上海赛百慷股份有限公司 货号:iCell-h054(STR 鉴定)。1.2 药物及试剂 赤芍、附片由湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房提供,批号分别为:2012003C、21030068S。参照前期研究7及临床常用剂量确定用量为赤芍50 g,附片15 g。方法:浸泡,饮片
12、 30 min,煎煮,混合所得药液,过滤后浓缩至 65 mL(即生药含量 1 g/mL),灭菌,4 冰箱保存备用。胎牛血清、Trizol(美国赛默飞)批号分别为:10099141、15596026;DMEM 培养基(美国默克)批号:D5796;D-半乳糖、脂多糖、CCK-8 试剂盒(北京索莱宝)批号分别为:G8110、L8880、CA1210;mRNA 及 miRNA 逆转录试剂盒(北京康为世纪)批号分别为:CW2569、CW2141;Copanlisib、戊二醛(北京爱普拜)批号分别为:B2178、AWI0097;IL-1、IL-6及TNF-、试剂盒(美国Proteintech)批号分别为:
13、KE00021、KE00139、KE00068。1.3 主要仪器 YT-CJ-2NB型工作台(北京亚泰隆);DH-160I 型二氧化碳培养箱(上海三藤);JEM1400型透射电子显微镜(日本电子);SL02 型低速离心机(知信仪器);PW-812 型酶标洗板机(深圳汇松);H1650R 型高速冷冻离心机(湖南湘仪)。1.4 含药血浆的制备 空白血浆组及“赤芍-附片”组每组随机分配 5 只大鼠,按体表面积换算法8算出每日大鼠等效剂量为5.85 g/kg,每日2次,持续5 d,“赤The expression levels of interleukin-1(IL-1),interleukin-6(
14、IL-6)and tumor necrosis factor-(TNF-)were detected by ELISA.The mRNA and protein expression levels of the PI3K/Akt signaling pathway were determined by quantitative real time PCR(RT-q PCR)and Western blot.Results Compared with the normal group,the number of damaged organelles and autophagosomes in t
15、he model group was increased,and the contents of IL-1,IL-6 and TNF-were significantly increased(P0.01),while the mRNA and phosphorylated protein expression levels of PI3K and Akt were significantly decreased(P0.01).Compared with the model group,the cell morphology was relatively normal in the medici
16、ne group,and the number of autophagosomes was reduced,the contents of IL-1,IL-6 and TNF-were significantly decreased(P0.01),while the mRNA and phosphorylated protein expression levels of PI3K and Akt were up-regulated(P0.01 or P0.05).Conclusion The couplet medicines of peony root and prepared common
17、 monkshood branched root may reduce the secretion of IL-1,IL-6 and TNF-by regulating the PI3K/Akt signaling pathway,so as to alleviate the liver cell injury induced by D-galactose combined with lipopolysaccharide.Keywords:peony root;prepared common monkshood branched root;medicated plasma;L02 cells;
18、PI3K/Akt signaling pathway 2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 967芍-附片”组用中药液灌胃,空白血浆组以蒸馏水代替。末次灌胃 1 h 后,10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉,腹主动脉采血,离心,过滤,56 水浴 30 min,-20冰箱保存备用。1.5 细胞培养和处理 L02 细胞培养于含 10%胎牛血清及 1%双抗的 DMEM 培基中,置于 5%CO2、37恒温饱和湿度培养箱,取对数生长期细胞进行实验。设置正常组、模型组、空白血浆组(15%空白
19、血浆)、“赤芍-附片”组(15%含药血浆)、Copanlisib(PI3K抑制剂)组(15%含药血浆+5 umol/L Copanlisib)。除正常组外,其余组细胞参考文献9给 D-半乳糖(44 g/mL)和脂多糖(100 ng/mL)预处理 24 h 造模。1.6 观察检测1.6.1 CCK-8 法筛选含药血浆浓度及干预时间 胰酶消化细胞,调整密度至 1105/mL。设置对照组、模型组、“赤芍-附片”组。“赤芍-附片”组按血浆浓度设置 5 个亚组(5%、10%、15%、20%、25%),分别加入相应浓度血浆使每孔总体积达到200 L,对照组及模型组则用培养液补齐。分别在培育 24 h、48
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