大蒜2个中性_碱性转化酶基因AsNI的克隆与表达分析.pdf
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1、华北农学报():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()年度中国科学院“西部之光”人才培养计划青海省科技厅重点实验室项目()作者简介:周倩怡()女陕西咸阳人在读硕士主要从事蔬菜分子研究通信作者:田 洁()女青海西宁人副研究员博士硕士生导师主要从事蔬菜生理与分子生物技术研究大蒜 个中性/碱性转化酶基因 的克隆与表达分析周倩怡黄思杰田 洁(.青海大学 农林科学院青海省高原种质资源研究与利用实验室青海 西宁.生态环境部 南京环境科学研究所江苏 南京)摘要:中性/碱性转化酶作为植物蔗糖代谢的关键酶主要参与植物生长发育、逆境胁迫响应等过程 为探究大蒜 对逆境胁迫的响应模式以乐都紫皮大蒜为试验材料克隆得到
2、 个中性/碱性转化酶基因并进行了生物信息学和表达特性分析 结果表明 和 的开放阅读框分别为 编码 个氨基酸与 均为亲水性蛋白预测定位于细胞质具有 结构域但二者的氨基酸序列相似性仅为.含有 个糖基化位点而 未检测到糖基化位点二者的亲缘关系较远 蛋白互作网络分析结果表明 与 可能参与不同的生化过程 启动子序列分析发现 和 的启动子区域含有多个与响应相关的顺式作用元件其中 启动子的干旱和低温胁迫响应元件个数显著大于 通过对启动子转录因子结合位点进行预测发现二者含有不同种类及数量的结合位点表明 和 可行使不同的基因功能 检测发现 的表达具有明显的组织特异性 和 分别在根和鳞茎中表达量最高 同时逆境胁迫
3、能够诱导 表达低温和干旱处理下均以 的响应程度强于 其中低温胁迫以诱导叶片 的表达为主干旱胁迫以诱导根系 的表达为主 通过分析 的序列特征和表达模式验证了 的抗逆功能关键词:大蒜中性/碱性转化酶基因基因克隆表达分析逆境胁迫中图分类号:.文献标识码:文章编号:():././(.):/./.期周倩怡等:大蒜 个中性/碱性转化酶基因 的克隆与表达分析 .:/蔗糖转化酶是植物体内蔗糖代谢的关键酶高等植物体内的蔗糖需要通过水解为己糖才能被吸收利用 蔗糖从光合活性组织(主要为成熟的叶片)运输到非光合作用的库(如花、果实、根)进而被降解成为己糖等其他衍生物用于各种生物过程 转化酶催化蔗糖的裂解将蔗糖转化为葡
4、萄糖和果糖在植物的初级代谢中起着关键作用蔗糖转化酶不仅参与了植物的生长发育还可以作为信号物质调节植物对非生物胁迫的抗性 根据发挥作用的最适的 可分为酸性转化酶()和中性/碱性转化酶(/)在之前的研究中酸性转化酶的功能及调控机制已经被广泛报道如酸性转化酶可以调控碳同化物库器官的发育和库强调节由于中性/碱性转化酶活性不稳定难以纯化导致人们对其功能知之甚少 最近的研究中人们发现中性/碱性转化酶在植物的生长发育过程中同样具有至关重要的作用 目前已经鉴定并从芒果、番茄、石斛、木薯等植物中克隆出中性/碱性转化酶 等克隆得到 个橡胶中性/碱性转化酶基因()其中 表现出 基因功能其动力特征与蔗糖浓度呈正相关
5、在茶树中鉴定出的中性/碱性转化酶在非生物胁迫下提高了植株的抗性大蒜(.)是百合科葱属植物富含多种营养和药用价值 蔗糖是大蒜糖积累的主要形式其含量不仅是影响大蒜的风味品质的重要因素也是植株抗逆性的体现 乐都紫皮大蒜是青海特有品种具有喜冷凉、产量高、品质好、商品性高的特点但青海年平均温度低降水量少会影响大蒜幼苗的生长发育 目前关于中性/碱性氧化酶对提高大蒜的抗逆作用研究较少对大蒜的中性/碱性氧化酶基因的克隆及胁迫下表达模式也鲜有报道 本研究以乐都紫皮大蒜为试材利用 克隆法对 进行克隆并进行生物学信息分析分析这 个基因在不同胁迫处理下不同组织的表达模式为探明逆境胁迫下大蒜 基因的分子响应机制提供了一
6、定的理论基础 材料和方法.试验材料本试验以乐都紫皮大蒜为材料播种于栽培基质配比为草炭 珍珠岩 蛭石 的盆钵中置于光照培养箱中进行培养 设置培养条件昼/夜:/相对湿度 光照强度:/()培养至大蒜苗高为 左右时进行分组培养处理:正常培养():培养条件不变相对湿度保持定期浇水保持土壤湿润干旱胁迫处理():通过停止浇水进行人工控水保持空气相对湿度 土壤湿度为 左右光周期及光照强度不变低温胁迫处理():将大蒜幼苗放置在昼/夜:/的培养条件下培养相对湿度保持 定期浇水保持土壤湿润光周期及光照强度不变分别取对照、低温胁迫处理()、干旱胁迫处理()大蒜根、假茎、鳞茎、叶片用于 的提取和 的合成上述采集样品立即
7、用液氮速冻于 保存.试验方法.总 的提取及 的合成 将采集的胁迫处理不同时期的大蒜组织材料的总 的提取利用 ()总 提取试剂进行 采用 琼脂糖凝胶和 微量分光光度计(天根生化科技有限公司)分别检测 完整性和质量 的合成按照 试剂盒进行 合成的 放在 冰箱进行保存备用.大蒜 基因的克隆 从大蒜基因组数据检索得到 条中性/碱性转化酶基因序列据此设计克隆引物()、()和 ()、()扩增模板为乐都紫皮大蒜假茎 华 北 农 学 报 卷 扩增条件:预变性 变性 退火 延伸 进行 个循环 延伸 .琼脂糖凝胶电泳回收产物连接 载体转化大肠杆菌感受态选取单克隆进行菌液 验证阳性克隆送至北京六合华大基因科技有限公
8、司测序.序列分析 蛋白质的理化性质通过 (:/./)在线网站进行预测分析跨膜结构域利用(:/./.?.)在线网站分析 亚细胞定位和信号肽预测利用(:/./.?)和 .(:/./.?.)进行 利用(:/./.)和 (:/./.?)分别进行蛋白质二、三级结构的预测 利用 .(:/./.?.)和.(:/./.?.)预测 蛋白的磷酸化位点和糖 基 化 位 点 利 用(:/./)在线分析蛋白基序的保守性使用 网站(:/./)预测蛋白的相互作用网络 在 数据库中获得拟南芥等其他植物的 序列使用.对系统进化树进行测试和编辑生成报告图 形 利 用 (:/./)预测 启动子序列的顺式作用元件 利用 网站(:/.
9、/.)预测转录结合位点.实时荧光定量 根据荧光定量试剂盒()在 上进行实时荧光定量 参考 等的研究以大蒜 基因为内参基因其引物序列为()、()根据克隆得到序列设计引物()、()、()、().数据分析采用 计算目的基因的相对表达水平显著性差异采用 的 法(.)进行分析 图表利用 软件进行绘制 结果与分析.大蒜转化酶基因 的克隆以乐都紫皮大蒜的 为模板使用特异性引物、和、进 行 扩增得到一条长度约为 和一条长度约为 的目的条带(图)片段大小与预期一致 测序结果表明 基因开放阅读框()全长 编码 个氨基酸(图)基因 全长 编码 个氨基酸(图)基因与 基因 序列的相似性为.分子量标准.图 大蒜 基因的
10、 扩增图谱.终止密码子 图 同.图 大蒜 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列.期周倩怡等:大蒜 个中性/碱性转化酶基因 的克隆与表达分析 图 大蒜 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列.大蒜 基因氨基酸序列分析.大蒜 蛋白的理化性质分析及亚细胞定位预测 利用 等对 与 基因编码的蛋白质的理化性质进行分析(表)结果表明 个蛋白均为亲水性蛋白均不稳定 有 个磷酸化位点 含有 个磷酸化位点 未检测到糖基化位点 含有一个糖基化位点亚细胞预测定位表明 个蛋白均位于细胞质表 大蒜 的蛋白质理化性质.理化性质分子式分子量/亲水性平均系数 不稳定系数磷酸化位点糖基化位点.(不稳定).(不稳定).大蒜 的蛋白
11、结构分析利用 对蛋白进行蛋白质二级结构预测(图)结果表明 二级结构包含的 螺旋、延伸结构、转角和无规则卷曲分别为.和.则分别包含.和.利用 软件进行同源建模蓝色.螺旋绿色.转角黄色.无规则卷曲红色.延伸结构 图 同.图 蛋白二级()、三级()结构预测.()()华 北 农 学 报 卷图 蛋白二级()、三级()结构预测.()()并通过 软件分析蛋白三级结构其结果显示 蛋白的三维结构由 个 螺旋和 个 折叠所构成 蛋白的三维结构由 个 螺旋和 个 折叠所构成.大蒜 蛋白的保守结构域分析利用 在线分析 蛋白基序的保守性(图)结果表明 和 均含有 个保守基序列但结构相差较大其中二者的 号基序相同且位置一
12、致的 号与 的 号、号与 号、号与 号基序相同但位置存在差异 通过 网站的 的程序对 蛋白进行功能域分析结果表明(图)蛋白在 氨基酸位点间有 结构域蛋白在氨基酸位点存在结构域此结构域是植物中性/碱性转化酶的保守结构域图 蛋白的保守基序分析.图 大蒜()、()氨基酸序列保守域预测.()().大蒜 的多序列对比和系统进化分析利用 对 与其他植物的 氨基酸序列进行同源性对比选取相似度较高的几个物种进行多重比较分析(图)与 氨基酸序列的相似性为.与拟南芥的相似性分别为.与铁皮石斛、野生稻、姜、玉米、高粱、黑麦草和短柄草的相似性分别为.和.表明大蒜与其他物种的 的氨基酸序列具有较高的同源性两端与其他蛋白
13、没有相似性且 端比其他蛋白少约 个氨基酸残基利用 .软件中的 法将大蒜与其他植物的 构建同源进化树(图)结果表明 与拟南芥属于同一分支在进化关系上最为接近 与铁皮石斛、野生稻和姜同属一个大分支亲缘关系较为接近 与 属于不同分支亲缘关系较远.大蒜 的蛋白互作网络预测利用 网站以拟南芥为模板构建大蒜 的蛋白互作网络(图)结果表明 和 均与参与糖代谢的细胞壁转化酶作用但 与 种细胞壁转化酶作用多于 此外 也和参与氨基酸磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶()、聚腺苷酸结合蛋白(、期周倩怡等:大蒜 个中性/碱性转化酶基因 的克隆与表达分析 短柄草(.)、凤梨(.)、柑橘(.)、高粱(.)、姜(.)、芦笋(.
14、)、木槿(.)、拟南芥(.)、铁皮石斛(.)、小麦(.)、野生稻(.)、黑麦草(.)、玉米(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.).图 与其他植物 氨基酸序列的多重比对.)和 葡聚糖转移酶()相互作用 与蔗糖合酶()、参与脱落酸形成的脱落酸缺乏酶()糖介导的根系发育调控过程中的 磷脂酰肌醇磷酸 激酶()也相互作用.大蒜 基因启动子序列分析及转录因子结合位点预测利用 在线网站对 个 基因进行启动子元件预测分析结果表明 基因不仅包含典型的 和 还包含其他重要 华 北 农 学 报 卷图 大蒜与其他作物 氨基酸序列的系统进化树.图 大蒜 和 的蛋白互作网络.
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