NCOA5通过调控上皮间质转化促进卵巢癌细胞的侵袭转移能力.pdf
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1、论著N C O A 5通过调控上皮间质转化促进卵巢癌细胞的侵袭转移能力*刘俊 成洁 庄珩之 王圣坦 刘晓行(海南省人民医院妇科,海南 海口 5 7 0 3 1 1)【摘要】目的 研究核受体共激活因子5(N C OA 5)对卵巢癌细胞侵袭和转移能力的作用及分子机制。方法 常规培养卵巢癌细胞株S KOV-3、A 2 7 8 0、O C 3、HO-8 9 1 0和正常卵巢上皮细胞系I O S E 8 0,W e s t e r n b l o t检测各细胞中N C OA 5蛋白的表达水平。选取高表达N C OA 5的卵巢癌细胞S KOV-3 和A 2 7 8 0,各分为s i-N C组、s i-N
2、C OA 5组,并分别转染N C s i R NA和N C OA 5 s i R NA。B o y d e n实验检测各组细胞侵袭能力,T r a n s w e l l实验检测各组细胞转移能力,W e s t e r n b l o t检测各组细胞上皮间质转(EMT)相关蛋白E-c a d h e r i n、N-c a d h e r i n、v i m e n t i n和S l u g蛋白的表达水平。结果 W e s t e r n b l o t结果显示N C OA 5在卵巢癌细胞中的表达显著上调(P0.0 5)。在S KOV-3和A 2 7 8 0细胞中干扰N C OA 5的表达均
3、显著抑制卵巢癌细胞侵袭和转移能力(P0.0 5),并促进EMT相关蛋白E-c a d h e r i n的表达,抑制细胞中EMT相关蛋白N-c a d h e r i n、v i m e n t i n和S l u g蛋白的表达(P0.0 5)。结论 N C OA 5促进卵巢癌侵袭转移能力,具有作为卵巢癌新型预后生物标志物和治疗分子靶点的潜力。【关键词】卵巢癌;N C OA 5;侵袭;转移;EMT【中图分类号】R 7 3 7.3 1 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 7 基金项目:海南省卫生
4、计生行业科研项目(1 8 A 2 0 0 1 1 4)通讯作者:王圣坦,E-m a i l:2 0 0 0 w a n g t a n 1 6 3.c o m引用本文:刘俊,成洁,庄珩之,等.N C OA 5通过调控上皮间质转化促进卵巢癌细胞的侵袭转移能力J.西部医学,2 0 2 3,3 5(9):1 2 8 2-1 2 8 6.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 7N C O A 5 p r o m o t e s t h e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s
5、 o f o v a r i a n c a n c e r c e l l s b y r e g u l a t i n g E p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o nL I U J u n,C H E N G J i e,Z H U A N G H e n g z h i,WA N G S h e n g t a n,L I U X i a o x i n g(D e p a r t m e n t o f G y n a e c o l o g y,H a i n a n P r o v i n c i a
6、 l P e o p l e s H o s p i t a l,H a i k o u 5 7 0 3 1 1,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s t u d y t h e r o l e o f N u c l e a r R e c e p t o r C o a c t i v a t o r 5(N C OA 5)o n o v a r i a n c a n c e r c e l l s a n d m o l e c u l a r m e c h a n i s m s.M e t h o d s O v a
7、 r i a n c a n c e r c e l l l i n e s S KOV-3,A 2 7 8 0,O C 3,HO-8 9 1 0 a n d n o r m a l o v a r i a n e p i t h e-l i a l c e l l l i n e I O S E 8 0 w e r e c u l t u r e d r e g u l a r l y.W e s t e r n b l o t a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n
8、l e v e l o f N C OA 5 p r o t e i n i n e a c h c e l l l i n e.O v a r i a n c a n c e r c e l l s S KOV-3 a n d A 2 7 8 0 w i t h h i g h e x p r e s s i o n o f N C OA 5 w e r e s e l e c t e d a n d d i v i d e d i n t o s i-N C g r o u p a n d s i-N C OA 5 g r o u p,r e s p e c t i v e l y,a n
9、 d t r a n s f e c t e d w i t h N C s i R NA a n d N C OA 5 s i R NA,r e s p e c t i v e l y.B o y d e n a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t c e l l i n v a s i o n a b i l i t y,T r a n s w e l l a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t c e l l m e t a s t a s i s a-b i l i t y,a n d W e s t e
10、r n b l o t a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f EMT-r e l a t e d p r o t e i n s E-c a d h e r i n,N-c a d h e r i n,v i m e n t i n a n d S l u g.R e s u l t s W e s t e r n b l o t r e s u l t s s h o w t h a t t h e e x p r e s s i o n o f N C OA 5 i
11、 n o v a r i a n c a n c e r c e l l s w e r e s i g n i f i-c a n t l y i n c r e a s e d(P 0.0 5).T h e e x p r e s s i o n o f i n t e r f e r e n c e N C OA 5 s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d o v a r i a n c a n c e r c e l l i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s(P 0.0 5),a n d p
12、r o m o t e d t h e e x p r e s s i o n o f EMT-r e l a t e d p r o t e i n E-C a d h e r i n,i n h i b i t e d t h e e x p r e s s i o n o f EMT-r e l a t e d p r o t e i n N-C a d h e r i n,V i m e n t i n,a n d S l u g p r o t e i n i n c e l l s(P 0.0 5).C o n c l u s i o n N C OA 5 p r o m o t
13、e s t h e m e t a s t a s i s o f o v a r i a n c a n c e r i n v a s i o n a n d h a s t h e p o t e n t i a l t o b e a n e w t y p e o f p r o g n o s i s o f o v a r i a n c a n c e r a n d t h e p o t e n-t i a l f o r t h e t r e a t m e n t o f m o l e c u l a r t a r g e t s.【K e y w o r d s
14、】O v a r i a n c a n c e r;N C OA 5;I n v a s i o n;M e t a s t a s i s;EMT 卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,其死亡率较高,全球每年约有1 4万患者死亡1,且由于缺乏早期临床症状和有效的筛查策略,大约7 5%的病例确诊时通常分期较晚2。目前减瘤手术和铂/紫杉醇2821西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.9联合化疗是卵巢癌的标准疗法,而随着医疗技术的持续发展,卵巢癌的治疗已
15、在一定程度上得到改善,但是大多数患者5年生存率仍低于5 0%3。卵巢癌的发病机制尚未完全明确,核受体共激活因子5(N u c l e-a r R e c e p t o r C o a c t i v a t o r 5,N C OA 5)是一种广泛表达的核受体共同调节剂,也是雌激素受体和孤儿核激素受体共激活因子B D 7 3的共同调节剂4。NC O A5基因表达异常可导致肿瘤的发生,在乳腺癌中N C OA 5表达增 加,促 进 乳 腺 癌 细 胞 的 增 殖 和 侵 袭 转 移 能力5。N C OA 5在宫颈癌组织中表达减少,并与宫颈癌患者不良临床病理参数和预后相关,抑制宫颈癌细胞增殖和转移
16、能力6。由此可见,N C OA 5在不同肿瘤中发挥的作用可能相反,其参与了几种恶性肿瘤的发生发展。但是它在卵巢癌中的作用仍然未知。因此本文在卵巢癌中研究N C OA 5的表达及发挥的生物学功能,以表明N C OA 5作为促进卵巢癌恶性进展的重要分子,具有作为抗卵巢癌治疗分子靶点的潜力。1 材料与方法1.1 试剂来源 卵巢癌细 胞株S KOV-3、A 2 7 8 0、O C 3、HO-8 9 1 0和正常卵巢上皮细胞系I O S E 8 0购自中国科学院细胞库(中国上海);R PM I-1 6 4 0培养基、胎牛血 清 和 青 链 霉 素 双 抗 购 自 美 国G i b c o公 司;N C
17、OA 5 s i R NA购于S a n t a C r u z生物技术有限公司;基质胶购自美国B D公司;T r a n s w e l l小室购自美国C o r n i n g公司;二辛可宁酸(B C A)蛋白质测定试剂盒和P V D F膜购自美国T h e r m o试剂公司;N C OA 5、E-c a d h e r i n、N-c a d h e r i n、v i m e n t i n、S l u g、GA P DH和HR P偶联的二抗购于英国A b c a m公司。1.2 细胞培养、分组和转染 卵巢癌细胞株S KOV-3、A 2 7 8 0、O C 3、HO-8 9 1 0和
18、 正 常 卵 巢 上 皮 细 胞 系I O S E 8 0快速复苏后均采用R PM I-1 6 4 0细胞培养基重悬,并加入胎牛血清(1 0%)和青霉素/链霉素的混合物(1%),放置在含有5%C O2的3 7 培养箱中培养,细胞长至9 0%左右时,胰酶消化进行细胞传代。S KOV 3及A 2 7 8 0细胞生长较好时,胰酶消化后以每孔21 05个细胞接种于6孔板内,分为s i-N C组和s i-N C OA 5组。按照L i p 2 0 0 0转染试剂说明书分别将N C s i R NA和N C OA 5 s i R NA转染至对应组的细胞中。转染4 8 h后,通过w e s t e r n-
19、b l o t检测沉默效率。1.3 B o y d e n实验 将B D基质胶在4 下解冻,采用无血清培养基稀释基质胶(稀释比例为1 1 0),取1 0 L稀释的基质胶均匀加至T r a n s w e l l小室的上室聚碳酸酯膜上,放置3 7 培养箱中3 0 m i n备用。胰酶消化s i-N C组和s i-N C OA 5组S KOV 3及A 2 7 8 0细胞重悬,采用无血清培养基洗3次并重悬细胞,将细胞密度调整为1.51 06个细胞/m L,接种至铺好的基质胶上,并在T r a n s w e l l小室的下室中加入1 0 0 L含有1 0%胎牛血清的培养基。在培养箱中孵育1 2 h后
20、,用棉签去除上室中的细胞,将聚碳酸酯膜放置4%多聚甲醛中固定,并采用结晶紫染料染色。在显微镜下随机选择5个不重叠的视野计算侵袭细胞数目。1.4 T r a n s w e l l实 验 胰 酶 消 化s i-N C组 和s i-N C OA 5组S KOV 3及A 2 7 8 0细胞重悬,采用无血清培养基洗3次并重悬细胞,将细胞密度调整为11 06个细胞/m L,接种至T r a n s w e l l小室的上室聚碳酸酯膜上,并在T r a n s w e l l小室的下室中加入1 0 0 L含有1 0%胎牛血清的培养基。在培养箱中孵育6 h后,用棉签去除上室中的细胞,将聚碳酸酯膜放置4%多聚
21、甲醛中固定,并采用结晶紫染料染色。在显微镜下随机选择五个不重叠的视野计算转移细胞数目。1.5 W e s t e r n-b l o t实验 胰酶消化s i-N C组和s i-N C OA 5组S KOV 3及A 2 7 8 0细胞,P B S洗3次后,加入含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的蛋白裂解液,经高速 离 心 获 得 蛋 白 裂 解 液。根 据 二 辛 可 宁 酸(B C A)蛋白检测试剂盒检测和计算蛋白质浓度。吸取5 0 g等量的蛋白质加入十二烷基硫酸钠(S D S)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,并将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜(P V D F)上。采用封闭液封闭P V D F膜上的非 特 异
22、 蛋 白,T B S T洗3次 后,将P V D F膜 与N C OA 5、E-c a d h e r i n、N-c a d h e r i n、v i m e n t i n、S l u g、GA P DH一抗稀释液(稀释浓度均为1 5 0 0 0)于4 中孵育过夜。T B S T洗3次后,将P V D F膜与兔、鼠二抗(稀释浓度均为1 8 0 0 0)孵育。采用E C L试剂盒检测蛋白条带。1.6 统计学分析 采用S P S S 2 0.0软件进行统计学分析,所有实验重复3次,计量数据以xs表示,3组间比较采用方差分析,两组间比较采用t检验分析。计数数据采用率表示,组间比较采用2检验分析
23、。通过K a p l a n M e i e r法绘制患者生存曲线,L o g-R a n k法进行统计检验,使用G r a p h P a d P r i s m软件作图。P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 N C OA 5在卵巢癌细胞系中表达上调 W e s t e r n b l o t检测N C OA 5在卵巢癌细胞株S KOV-3、A 2 7 8 0、O C 3、HO-8 9 1 0中的表达分别为0.8 90.0 8、0.9 10.1 0、0.1 90.0 3、0.2 10.0 4,显著高于在正常卵巢上皮细胞系I O S E 8 0中的表达(0.0 80.0 3)(F=1
24、 0 3.7 9,P0.0 0 1)。其中在S KOV-3和A 2 7 8 0细胞中的表达相对较高(P0.0 5),见图1。3821西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.9 图1 W e s t e r n b l o t检测N C O A 5蛋白在卵巢癌细胞中的表达F i g u r e 1 T h e N C O A 5 p r o t e i n s e x p r e s s i o n i n o v a r i a n c a n c e
25、r c e l l s w a s d e-t e c t e d b y W e s t e r n b l o t2.2 N C OA 5 s i R NA转染卵巢癌细胞效果 W e s t-e r n-b l o t结 果 显 示,N C OA 5蛋 白 在s i-N C组 和s i-N C OA 5组S KOV 3细胞中的表达分别为0.3 10.0 4和0.1 10.0 2,与s i-N C组相比,s i-N C OA 5组卵巢癌细胞 中N C OA 5的 表 达 显 著 降 低(t=7.7 4 6,P=0.0 0 1),见图2 A。在s i-N C组和s i-N C OA 5组A 2
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