3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家重点研发项目子课题(2021YFC3201005);安徽省高校省级自然科学研究项目-创新团队(2022AH010019);国家自然科学基金资助项目(21677001).第一作者:张颖(1998),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail:awm_ *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221026001张颖,张瑾,周娜娜,等.
2、3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估J.生态毒理学报,2023,18(3):465-477Zhang Y,Zhang J,Zhou N N,et al.Quantitative evaluation of combined toxicity interactions of three plasticizers on phtobacterium Q67 J.Asian Journalof Ecotoxicology,2023,18(3):465-477(in Chinese)3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估张颖1,张瑾1,2,拾,周娜娜1,陈如荔1,申慧彦1,21
3、.安徽建筑大学环境与能源工程学院,合肥 2306012.安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室,合肥 230601收稿日期:2022-10-26 录用日期:2022-12-24摘要:增塑剂(plasticizers,PLAs)是工业生产中广泛使用的高分子材料助剂,伴随着主产品的使用而进入环境中,很可能会对环境中的生物甚至人类的健康产生危害。因此,以 3 种常见的 PLAs:双酚 A(bisphenol A,BPA)、双酚 S(bisphenol S,BPS)和三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBEP)为研究对象,运用直接均分和均匀设计射线法分别设计
4、二元和三元混合物体系,应用时间微板毒性分析方法系统测定 3 种污染物及其混合物体系对淡水发光菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensissp.-?Q67,Q67)的毒性,应用浓度加和(concentration addition,CA)分析混合物的毒性相互作用,采用绝对残差(deviation from CAmodel,dCA)定量评估毒性相互作用强度,并结合热图法分析相互作用强度变化规律。采用电镜扫描分析 Q67 细胞形态,二苯胺显色法和考马斯亮蓝法测定 Q67 细胞的 DNA 和可溶性蛋白质大分子的泄露情况来探究3 种 PLAs 及其混合物可能的毒性作用机理。结果表明,BPA、BPS
5、、TBEP 对 Q67 均具有明显的急性毒性,且急性毒性均大于长期毒性;以半数效应浓度负对数值为毒性指标,3 种 PLAs 在同一暴露时间的毒性顺序:BPABPSTBEP;混合物体系 BPA-BPS 呈现协同作用,而 BPS-TBEP、BPA-TBEP、BPA-BPS-TBEP 呈现拮抗作用,且相互作用强度均受暴露时间和混合物浓度的影响;BPA-BPS-R4 射线的协同作用强度最强,dCA 绝对值为 0.411,BPA-BPS-TBEP-R1 射线的拮抗作用最明显,dCA 绝对值为 0.670;3 种 PLAs 及其混合物对Q67 的作用主要通过破坏细胞的结构和形态,使其 DNA 和可溶性蛋白
6、质大量流失,造成细胞大量死亡。关键词:增塑剂;青海弧菌;拮抗作用;协同作用;时间依赖性,热图文章编号:1673-5897(2023)3-465-13 中图分类号:X171.5 文献标识码:AQuantitative Evaluation of Combined Toxicity Interactions of Three Plasti-cizers on Phtobacterium Q67Zhang Ying1,Zhang Jin1,2,*,Zhou Nana1,Chen Ruli1,Shen Huiyan1,21.College of Environment and Energy Engin
7、eering,Anhui Jianzhu University,Hefei 230601,China2.Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province,Hefei 230601,ChinaReceived 26 October 2022 accepted 24 December 2022Abstract:Plasticizers(PLAs)are widely used in industrial production as additives to polymeric ma
8、terials,whichenter the environment along with the main product and are likely to be hazardous to organisms in the environmentand even to human health.Therefore,three common PLAs,bisphenol A(BPA),bisphenol S(BPS)and tris(2-bu-466 生态毒理学报第 18 卷toxyethyl)phosphate(TBEP),were selected as research objects
9、 and their binary and ternary mixtures were designedby direct equipartition and uniform design ray methods,respectively.The toxicity of the three contaminants andtheir mixture systems to a freshwater luminescent bacteriumVibrio qinghaiensissp.-Q67(Q67)was systematicallydetermined by the time-depende
10、nt microplate toxicity analysis(t-MTA).The concentration addition model(CA)was applied to analyze the toxic interactions of mixtures and the deviation from CA model(dCA)combined withthe heatmap method used to analyze the intensity and variation of toxic interactions.To investigate the possiblemechan
11、isms of toxic effects of three PLAs and their mixtures,the cell morphology of Q67 was analyzed by scan-ning electron microscope,and the leakage of DNA as well as soluble protein macromolecules from Q67 cells weredetermined by diphenylamine colorimetry and the Coomassie Brilliant Blue methods,respect
12、ively.The resultsshowed that BPA,BPS and TBEP were all of acute toxicity to Q67,and the acute toxicity was stronger than theirlong-term toxicity.By selecting the negative logarithm of median effect concentration(pEC50)as the toxicity index,the toxicity order of the three PLAs was:BPABPSTBEP in the s
13、ame exposure time.The mixture system BPA-BPS showed synergistic effects,while BPS-TBEP,BPA-TBEP and BPA-BPS-TBEP showed antagonistic effectswhose interaction strength was influenced by exposure time and concentration.The strongest synergistic effect dis-played in BPA-BPS-R4 ray with the maximum abso
14、lute value of dCA(0.411),whereas the strongest antagonisticeffect showed in BPA-BPS-TBEP-R1 ray with an absolute dCA value of 0.670.The effects of the three PLAs andtheir mixtures on Q67 were mainly through the destruction of the structure and morphology of the cells,causingmassive loss of their DNA
15、 and soluble proteins,resulting in massive cell death.Keywords:plasticizer;Vibrio qinghaiensissp.-Q67;antagonism;synergism;time-dependence;heatmap 增塑剂(plasticizers,PLAs)是工业生产中广泛使用的高分子材料助剂,是一类重要的化工产品添加剂,作为助剂普遍应用于塑料制品、混凝土、泥灰、水泥、石膏、化妆品及清洗剂等材料中1。在长期使用与储存过程中,这些 PLAs 进入环境中,随环境介质发生迁移,不仅污染了环境,还有可能危害生物与人体健康。
16、陈寒嫣2的研究表明磷酸三苯酯、三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBEP)和磷酸三(1,3-二氯丙基)酯 3 种磷酸酯类 PLAs 即使在低浓度下,也会导致斑马鱼凋亡途径下游基因Cas3、Cas9的表达增加,从而诱发凋亡相关蛋白的?凋亡途径。Xu 等3研究发现邻苯二甲酸酯类增塑剂可能会使非洲爪蟾胚胎发育异常、死亡率升高。因此,PLAs 作为新兴有机污染物所可能带来的潜在风险引起了广泛关注。双酚 A(bisphenol A,BPA)、双酚 S(bisphenol S,BPS)、TBEP 和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(bis(2-eth-ylhexyl
17、)phthalate,DEHP)是生活中常用的 PLAs,其中 BPA 是一种常见的环境雌激素,常作为化妆品、食品的包装材料以及其他产品的 PLAs4。然而,有研究者发现 BPA 对斑马鱼的繁殖具有显著的抑制效应,长期接触 BPA 可对其繁殖性能及后代品质产生一定的影响5,BPA 还可引起甲状腺激素水平变化、肝脏机能变化、生育能力下降、流产等6。BPS是目前最常用的 BPA 替代物,在塑料制品包装等领域得到了广泛的应用7。BPS 和 BPA 的结构相似,已有研究显示 BPS 有类似 BPA 的作用,对动物的生殖、免疫、神经和代谢都有毒性8-9。BPS 能影响幼鼠的取食和幼仔的早期发育10-11
18、。刘倩等12的研究表明 BPS 暴露导致斑马鱼仔鱼视网膜受损,随着BPS 浓度的增加,BPS 对斑马鱼仔的毒性作用也将显著增加。TBEP 作为常用有机磷酸酯类的 PLAs广泛添加于家具、清漆、塑料、纺织品和电子材料等工业产品中13。在中国北京(308.1 ngL-1)和加拿大安大略省(约 10 gL-1)的废水处理厂中的曾检测出较高浓度的 TBEP14-15。TBEP 广泛存在于环境中,然而 TBEP 对生物体有一定的内分泌干扰、神经毒性等,甚至含量很低时都会对环境和生态系统的稳定性有负面影响16。蔡凤森17进行的急性毒性试验以鲤鱼为指示性生物,探究 TBEP 毒性,TBEP 的 LC50为1
19、0.04 mg L-1。以上研究表明,系统开展 PLAs 的环境安全性研究具有重要的实际环境意义。目前关于 PLAs 的单一毒性研究已有报道18,但有关 PLAs 对生物的联合毒性研究报道较少。因此,本文拟以 3 种 PLAs(BPA、BPS 和 TBEP)为研究第 3 期张颖等:3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估467 对象,应用直接均分射线法(direct equipartition ray,EquRay)和均匀设计射线法(uniform design ray,UD-Ray)分别设计 3 种 PLAs 的二元混合体系(BPA-BPS、BPS-TBEP、BPA-TBEP)和三
20、元混合物体系(BPA-BPS-TBEP),每个混合体系分别设计 5 条不同浓度配比的射线(R1、R2、R3、R4、R5),以青海弧菌(Vibrio qinghaiensissp.-Q67,Q67)为指示性生物,采?用时间微板毒性分析法(time-dependent microplatetoxicity analysis,t-MTA),测定不同暴露时间(0.25、2、4、8 和12 h)Q67 的发光值,采用浓度加和(concentra-tion addition,CA)模型和绝对残差(deviation from CAmodel,dCA)模型进行混合物毒性相互作用的定性与定量分析,所得结果可为
21、 PLAs 毒性风险评估提供一定的理论与数据参考。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 材料与仪器实验所用菌种为青海弧菌 Q67,从北京滨松光子技术股份有限公司采购,菌种的培养与保存参照文献19。3 种增塑剂 BPA、BPS、TBEP,纯度均99%,均购于国药集团化学试剂有限公司,其基本理化性质列于表 1。3 种试剂的储备液均采用 Milli-Q 水配制,保存于 4 冰箱中,备用。本实验过程中所用到主要实验仪器有 Synery 2Multi-Mode 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、UV-2600i 紫外可见分光光度计和 AURIGA 冷场发射扫描电子显微镜(德国
22、 ZEISS 公司)等。1.2 微板毒性分析法3 种 PLAs 及其混合物对 Q67 的毒性测定采用t-MTA 法20。按预实验的稀释因子设置 12 个浓度梯度,配制好的各浓度100 L 加入到标准的白色不透明微板中,最终在每个微孔中加入100 L 处于对数生长期的 Q67 菌液使得每孔总体积为200 L,置于(221)培养箱中,在不同暴露时间(0.25、2、4、8和12 h)取出,用酶标仪测定 Q67 的发光值数据。为减少实验误差,每个实验组均设置 3 个平行样减少误差,详细过程见文献20。表 1 3 种增塑剂的基本理化性质及 Weibull 函数的拟合参数Table 1 Basic phy
23、sicochemical properties and fitting parameters of the Weibull function for three plasticizers化合物Name分子式MolecularformulaCAS 号CASnumber分子量Molecularweight储备液浓度/(mol L-1)Stockconcentration/(mol L-1)时间/hTime/hRMSErEC50/(mol L-1)pEC50双酚 A(BPA)Bisphenol A(BPA)C15H16O280-05-7228.298.76E-050.257.591.550.0330
24、.99287.36E-065.1326.801.430.0420.98549.74E-065.0146.211.390.0420.97961.86E-054.7386.521.490.0590.95862.39E-054.62127.691.770.0410.97852.81E-054.55双酚 S(BPS)Bisphenol S(BPS)C12H10O4S80-09-1250.274.79E-030.258.112.110.0410.98959.61E-054.0227.322.060.0350.99461.86E-043.7348.192.420.0460.99202.91E-043.54
25、88.082.530.0500.99014.59E-043.34128.762.720.0770.98254.41E-043.36三丁氧基乙基磷酸酯(TBEH)Tris(2-butoxyethyl)phosphate(TBEH)C18H39O7P78-51-3398.475.00E-030.2510.503.150.0250.99793.55E-043.4528.992.820.0510.99024.81E-043.3248.672.680.0420.99334.25E-043.37810.463.310.0470.99255.36E-043.271211.833.820.0490.99206
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