MicroRNA-1184在胃癌细胞中的表达及作用.pdf
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1、:临床实验研究 在胃癌细胞中的表达及作用张小莉,王秀平,邵世和,毛旭华(江苏大学附属宜兴人民医院检验科,江苏宜兴;江苏大学医学院,江苏镇江)摘要:目的 探讨()在胃癌细胞系中的表达水平及其对胃癌细胞增殖、迁移、细胞周期及凋亡等生物学行为中的作用。方法 通过实时荧光定量 检测胃癌组织及人胃黏膜上皮细胞系 中 的表达水平;通过 试验、平板克隆形成试验、迁移试验及细胞划痕试验检测胃癌细胞的增殖和迁移能力;通过流式细胞术检测胃癌细胞系的细胞周期及凋亡率的变化;通过 检测胃癌细胞上皮间质转化()、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的表达水平;通过双荧光素酶报告基因试验检测 与异柠檬酸脱氢酶()()的靶向关系。结
2、果与胃癌旁组织及人胃黏膜上皮细胞 相比,在胃癌组织中呈低表达(,),且在胃癌细胞系 和 中呈低表达(,;,)。与对照组相比,转染 抑制剂可促进胃癌细胞的增殖(,)、迁移(,)、进程,期细胞周期转换以及细胞凋亡减少(,);转染模拟物可抑制胃癌细胞的增殖(,)、迁移(,)、进程、期细胞周期转换以及细胞凋亡增加(,);可与 靶向结合,其抑制剂可使胃癌细胞中 蛋白的表达量增加(,),而其模拟物可使胃癌细胞中 蛋白的表达量减少(,)。结论 在胃癌组织和细胞系中呈低表达,可影响胃癌细胞增殖、迁移、进程、细胞周期 期转换及细胞凋亡等生物学行为。关键词:胃癌;增殖;细胞周期;细胞凋亡中图分类号:;文献标志码:
3、,(,;,):(),(),(),()()(,)(,;,),(,),(,),(,)(,),(,),(,)(,),(,),:;临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,基金项目:国家自然基金面上项目();国家自然科学基金青年项目()。作者简介:张小莉,年生,女,副主任技师,硕士,主要从事微生物与感染及细菌耐药机制研究。通信作者:邵世和,教授,博士,:;毛旭华,副主任技师,硕士,:。胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,多数胃癌患者早期无明显症状,被确诊时通常是晚期,患者的总体预后较差。全面了解胃癌的发病机制,寻找新的潜在诊断标志物和治疗靶点是提高胃癌诊断和治疗水平的关键。近年来的研究表明,微小(,)在胚胎发育、
4、组织形成等生物学过程中发挥重要作用,同时也参与了骨关节炎、糖尿病等的发生、发展。是 家族中的一员,参与了包括前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的进展过程,但其在胃癌发展中的作用尚未明确。本研究旨在通过转染靶向 或,外源性抑制或过表达 的表达水平,初步探讨 对胃癌细胞增殖、迁移、细胞周期及细胞凋亡的影响及其对异柠檬酸脱氢酶()(),的靶向关系。材料和方法 主要试剂及仪器 细胞蛋白质提取试剂和(上海碧云天生物技术公司),细胞培养基、胎牛血清、转染试剂、小室(美国 公司),模 拟 物 及 阴 性 对 照、抑制 物 及 阴 性 对 照(上海吉玛制药技术公司),兔抗人 钙黏蛋白()、钙黏
5、蛋白()、蜗牛 蛋 白()、波 形 纤 维 蛋 白()、蛋白(,)、淋巴细胞瘤 基因蛋白(,)、多克隆抗体,标记的羊抗兔 二抗(美国 公司),细胞周期蛋白()抗体和 周期试剂盒(沈阳万类生物科技公司),逆转录合成试剂盒、高特异性染料法定量 检测试剂盒、凋亡检测试剂盒、检测试剂盒和双荧光素酶试剂盒(南京诺唯赞生物科技公司)。超微量分光光度计(美国 公司),吸收光酶标仪(美国 公司),培养箱(德国 公司),仪(美国应用生物系统公司),垂直蛋白电泳仪和凝胶成像分析系统(美国 公司),化学发光成像仪(美国通用电气医疗集团),流式细胞仪(美国贝克曼生物公司),倒置显微镜(日本 公司),发光检测仪(美国
6、公司)。组织样本及细胞来源收集 年 月至 年 月于镇江市第一人民医院普外科接受手术切除的原发性胃癌患者的癌组织和癌旁组织样本 例,其中男 例,女 例,年龄 岁,中位年龄 岁。纳入标准:()经组织病理切片证实为原发性胃癌;()术前未经放疗、化疗等抗肿瘤治疗。排除标准:()转移及术后复发肿瘤和良性胃肿瘤;()合并有其他部位肿瘤;()伴有其他严重疾病。本研究获得江苏大学伦理委员会审核批准(批准文号:江大校),所有研究对象均签署知情同意书。标本取材后置于 保存。人胃癌细胞系、和 细胞(人胚肾细胞)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,人胃黏膜上皮细胞系 保藏于本实验室。细胞培养及细胞转染取生长
7、状态良好的、和 细胞接种于含 的 培养基中,置于 、的培养箱中培养。将稳定培养的 和 细胞接种于 孔细胞培养板中,待细胞融合度达时,按 转染试剂说明书进行转染,配制转染试剂:无血清培养基,充分混匀,静置;各转染组按以下试剂配制工作液:组(无血清培养基)、组(无血清培养基)、对照组(无 血 清 培 养 基):对照组(无血清培养基),充分混匀,静置 ;将转染试剂和转染组工作液混合,充分混匀后静置 ,加入 孔细胞培养板中,置于 培养箱培养 ,备用。总 提取及实时荧光定量 用 试剂裂解细胞并提取细胞总,使用 超微量分光光度计检测 的纯度和浓度,取吸光度()值在 之间,浓度 的样本用于后续试验,剩余样本
8、置于 保存待用。按逆转录试剂盒说明书将 逆转录为,标本置于 保存。根据 数 据 库(:)登录的 和内参 临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,基因(序列号分别为 和),用 软件设计引物,并由上海生工公司合成。上游引物序列:,下游引物序列:,退火温度为 ,产物片段大小为;上游引物序列:,下游引物序列:,退火温度为 ,产物片段大小为 。总反应体系为,包括 ,上、下游引物各,水 。循环参数:;,共 个循环,于 时收集荧光信号;,绘制熔解曲线,用仪器配套的 软件进行熔解曲线分析,熔解曲线呈单峰,且出峰位置为引物的退火温度表明扩增产物特异性好。每个样本设置 个复孔,重复 次,以 法计算 的相对表达量。公式
9、:(实验组 实验组)(对照组 对照组)。试验分别收集 中转染 的 细胞(组及 组)、细胞(组及 组)并计数,以 个 孔细胞密度加入至 孔细胞培养板,设置 个复孔。用含 的 培养基补足终体积为 ,置于细胞培养箱培养。分别于、共 个时间点时每孔加入 试剂,避光培养 。用 吸收光酶标仪检测 处吸光度()值,绘制细胞生长曲线。平板克隆试验 分别收集 中转染 的 细胞(组及 组)、细胞(组及 组)并计数,以 个 孔的细胞密度加入至 孔细胞培养板,设置 个复孔。用含 的 培养基将每孔体积补足至 ,置于细胞培养箱培养。当板中生长出肉眼可见的细胞克隆时终止培养。多聚甲醛固定,结晶紫染色,洗去多余染液。拍照并用
10、 软件计数大于 个细胞的克隆数。迁移试验在 孔细胞培养板中加入 含 的 培养基,置于 小室中。分别收集 中转染 的 细胞(组及 组)、细 胞(组 及 组),用无血清重悬并计数,以 个 孔的密度加入至 小室上室中,每组设置 个复孔。常规培养 后取出小室,多聚甲醛固定,结晶紫染色,洗去多余染色液。显微镜下观察并随机拍照 个视野(),用 软件计数迁移至 小室下表面膜上的细胞,并进行统计学分析。细胞划痕试验 用 枪头在分别收集中转染 的 细胞(组及 组)、细胞(组及 组)培养板中垂直划痕,洗去漂浮细胞,加入 无血清培养基,置于 ,培养箱中培养。于、时在相同位置用光学显微镜拍照,用 软件分析细胞划痕面积
11、。细胞划痕愈合百分比(初始划痕面积某一时间划痕面积)初始划痕面积。流式细胞检测 分别收集 中转染 的 细胞(组及 组)、细 胞(组 及 组),通过流式细胞仪检测 抑制或过表达对 或 细胞周期及细胞凋亡的影响。用 胰蛋白酶消化细胞并制备细胞悬液(),冷乙醇固定细胞 至过夜,加入 ,水浴 ,加入 染液,避光染色 ,溶液混合后用流式仪记录激发波长 处红色荧光,用 软件分析细胞周期;细胞凋亡试验中分别收集 转染组中 组和 组作为实验组,组和 组为作为对照组,收集未经转染处理的 和 细胞样本作为阴性对照组,此外,进行流式检测时分别取实验组进行 和 单染,用于调节补偿。用无 的 胰蛋白酶消化细胞,、离心
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