不同载体材料固定Sphingobium.pdf
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1、第 60 卷 第 4 期 土 壤 学 报 Vol.60,No.4 2023 年 7 月 ACTA PEDOLOGICA SINICA Jul.,2023 *国家重点研发计划项目(2020YFC1807000,2019YFC1804400,2019YFC1804203)、国家自然科学基金项目(42007133,41977137)和江苏省自然科学基金项目(BK20191107)共同资助 Supported by the National Key Research and Development Program of China(Nos.2020YFC1807000,2019YFC1804400,2
2、019YFC1804203),the National Natural Science Foundation of China(Nos.42007133,41977137),and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province(No.BK20191107)通讯作者 Corresponding authors,E-mail:; 作者简介:尹 媛(1996),女,山东日照人,硕士研究生,主要从事环境化学研究。E-mail: 收稿日期:20220222;收到修改稿日期:20220420;网络首发日期():20220701 http:/ DOI:
3、10.11766/trxb202202220071 尹媛,生弘杰,王紫泉,相雷雷,付玉豪,卞永荣,蒋新,王芳.不同载体材料固定 Sphingobium sp.PHE3 对溶液中菲的降解研究J.土壤学报,2023,60(4):11921202.YIN Yuan,SHENG Hongjie,WANG Ziquan,XIANG Leilei,FU Yuhao,BIAN Yongrong,JIANG Xin,WANG Fang.Effects of Different Carrier Materials on the Degradation of Phenanthrene by Sphingobium
4、 sp.PHE3J.Acta Pedologica Sinica,2023,60(4):11921202.不同载体材料固定Sphingobium sp.PHE3对溶液中菲的降解研究*尹 媛1,2,生弘杰3,王紫泉1,相雷雷1,付玉豪1,卞永荣1,2,蒋 新1,2,王 芳1,2(1.中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室,中国科学院南京土壤研究所,南京 210008;2.中国科学院大学,北京 100049;3.农业农村部长江下游平原农业环境重点实验室,江苏省农业科学院农业资源与环境研究所,南京 210014)摘 要:为探究不同载体材料对微生物降解菲的影响,以蒙脱石、针铁矿、玉米秸秆炭为载体,采用
5、吸附挂膜法对菲降解菌株(革兰氏阴性菌鞘脂菌 PHE3)进行固定化,并应用固定化微生物降解溶液中的菲。根据扫描电镜结果,该菌株在玉米秸秆炭载体表面附着生长数量最多,形态最优。添加蒙脱石和玉米秸秆炭显著(P0.05)提高了微生物对菲的降解率,加快了菲的微生物降解速率,同时促进了细菌胞外聚合物(EPS)中多糖和蛋白质产量的增加,但添加针铁矿对菲的微生物降解和EPS 的产生促进作用较弱。此外,鞘脂菌 PHE3 在形成生物膜的过程中可能有群体感应现象发生,能够分泌信号分子 C8-HSL和 C12-HSL,可能在一定程度上调控 EPS 的生成和污染物的降解。关键词:菲;微生物降解;载体;胞外聚合物;酰基高
6、丝氨酸内酯 中图分类号:X53 文献标志码:A Effects of Different Carrier Materials on the Degradation of Phenanthrene by Sphingobium sp.PHE3 YIN Yuan1,2,SHENG Hongjie3,WANG Ziquan1,XIANG Leilei1,FU Yuhao1,BIAN Yongrong1,2,JIANG Xin1,2,WANG Fang1,2(1.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation,Institute
7、 of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Key Laboratory of Agro-Environment in Downstream of Yangtze Plain,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Institute of Agricultural Resources and Environment,Jiangsu
8、 Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China)4 期 尹 媛等:不同载体材料固定 Sphingobium sp.PHE3 对溶液中菲的降解研究 1193 http:/ Abstract:To explore the effect of different carrier materials on microbial degradation of phenanthrene,the biodegradation of phenanthrene was investigated in the liquid phase by gram-n
9、egative bacteria Sphingobium sp.PHE3 immobilized on montmorillonite,goethite and maize straw-derived biochar.The results of scanning electron microscopy showed that there was the largest number of bacteria adhered to the surface of the biochar with the best morphology.The addition of montmorillonite
10、 and biochar significantly(P97%,购自 TCI 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。实验过程中所用色谱纯有机溶剂丙酮、二氯甲烷、乙腈和 AHLs 标准品(C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3OC6-HSL、3OC8-HSL、3OC10-HSL、3OC12-HSL 和 3OC14-HSL),纯度99.9%,购自美国 Sigma-Aldrich 公司。蒙脱石、高岭石、针铁矿,纯度98%,购自国药集团化学试剂有限公司,过 100 目筛。玉米秸秆炭以玉米秸秆为原料,去离子水洗涤,烘箱烘干 12 h 后,
11、于马弗炉中热解,热解温度为 500。制备好的玉米秸秆炭研磨过 100目筛。营养肉汤培养基购自青岛高科技工业海博生物技术有限公司,其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。实验所用营养肉汤培养基配方为:蛋白胨 10 gL1,牛肉浸粉 3 gL1,NaCl 5 gL1。无机盐培养基的配制方法24如下:称取 2.3 mg MnCl22H2O、3.0 mg MnCl4H2O、3.1 mg H3BO3、3.6 mg CoCl26H2O、1.0 mg CuCl22H2O、2.0 mg NiCl26H2O、3.0 mg Na2MoO42H2O 和 5.0 mg ZnCl2溶于 100 mL 去离子水配制微
12、量元素溶液,调节 pH为 7;之后称取 8.8 g Na2HPO412H2O、3.0 g KH2PO4、1.0 g NH4Cl 和 0.5 g NaCl,加入 1 mL 1 molL1 MgSO4和 2.5 mL 微量元素溶液,定容至 1 L。菲降解菌鞘脂菌 PHE3(Sphingobium sp.PHE3)为本课题组从多环芳烃污染土壤中分离到的一株革兰氏阴性菌,能够以菲为唯一碳源生长,命名为PHE3,保存于中国典型培养物保藏中心,保藏号CCTCC AB 2010361。菌株 PHE3 在灭菌的营养肉汤培养基中活化和进一步扩大培养,于 28、160 rmin1避光振荡培养,待菌株生长到对数期,
13、离心收集菌体,用磷酸盐缓冲液清洗 2 次后,加入无机盐培养基重新悬浮菌体,调节 OD600 值为 0.85备用。1.2 载体筛选 向 40 mL 离心管中添加 0.1 g 载体(蒙脱石、高岭石、针铁矿和玉米秸秆炭),经灭菌处理后,继续添加 9 mL 灭菌的营养肉汤培养基,按照 10%的接种比例24,接种 1 mL 菌悬液,于 28、160 rmin1条件下避光振荡培养 2 d。培养结束后,离心收集载体,根据 Zhang 等25报道的方法观察附着在载体表面的细菌,首先用磷酸盐缓冲液清洗 2 次,接着加入 2.5%的戊二醛溶液固定 2 h,然后依次用 30%、50%、70%和 90%的乙醇脱水 1
14、0 min。最后样品经超临界干燥仪(Emitech K850,英国)干燥后采用扫描电镜(FEI Quanta 200,芬兰)观测。1.3 不同载体体系中菲的微生物降解 向 40 mL 玻璃离心管中添加 0.1 g 载体(蒙脱石、玉米秸秆炭、针铁矿),经灭菌处理后,向每支离心管中添加 9 mL 灭菌的无机盐培养基,随后分别添加 10 L 或 50 L 菲的丙酮溶液(2104 mgL1),使两种体系中菲浓度为 20 或 100 mgL1,然后按照10%的接种比例,接种 1 mL 已制备的菌液25,用盐酸将体系 pH 调整至 6.8 左右,同时设置不添加载体的接菌处理、只添加载体和不添加载体不接菌的
15、对照处理。将所有的离心管置于摇床中,28、160 rmin1避光振荡培养,每隔一定时间破坏性取三组平行样品,测定菲残留量。另外取三组测定 EPS以及 AHLs。降解实验结束后,离心收集载体,采用扫描电镜观测载体上降解菌的负载情况。1.4 菲的提取和测定 每个处理取三组平行样品,每个离心管中加入20 mL 萃取剂(丙酮二氯甲烷=13,v/v)振荡混合,超声处理 2 h,提取残留菲26。取悬浮液2 000 rmin1离心 5 min,分离水相和有机相。有机相经 0.22 m 尼龙有机滤膜过滤。采用高效液相色谱法(Agilent1260,Agilent,美国),配备多环芳烃专用柱(250 mm4.6
16、 mm,5 m)和荧光检测器,测定萃取物中的菲11。菲的激发波长为 245 nm,发射波长为 365 nm。流动相为乙腈和超纯水(91,v/v),流速为 1.5 mLmin1。在不同载体体系加入菲(20 mgL1)进行质量控制实验,采样和分析步骤与上述相同。菲的回收率在 99.7%105.2%之间。1.5 胞外聚合物的提取和测定 采用阳离子交换树脂法提取降解菌产生的EPS8。向不同处理组的离心管中加入 1.0 g 阳离子交换树脂(CER,0017,钠型,三兴),2 500 rmin1振荡 2 h,静置 5 min 以分离 CER。将上悬液在4 000 rmin1、4条件下离心 20 min,取
17、上清液通4 期 尹 媛等:不同载体材料固定 Sphingobium sp.PHE3 对溶液中菲的降解研究 1195 http:/ 过 0.45 m 水系滤膜过滤去除颗粒和细菌细胞,4储存,之后用于 EPS 的生化成分分析。EPS 中的多糖含量采用苯酚硫酸法测定,以葡萄糖为标准物质绘制标准曲线27。EPS 中的蛋白质含量采用 Folin-酚法测定,以牛血清白蛋白为标准物质绘制标准曲线25。1.6 AHLs 的提取和测定 在菲的微生物降解过程中,提取并测定不同降解体系中菌株生成的 AHLs。将悬浮液转移至离心管中,加入 20 mL 0.02 molL1冰醋酸的乙酸乙酯萃取 AHLs28,超声处理
18、1 h,离心取上层有机相,按同样的方法重复萃取两次,混合有机相,旋转蒸发至近干,用乙腈定容至 100 L,过 0.22 m 尼龙有机滤膜。采用高效液相色谱/串联质谱(HPLC-MS/MS)对提取物中 AHLs 进行分析29,建立了 12 种AHLs 的检测方法。流动相由 0.1%的甲酸水溶液和乙腈组成,流速为 0.25 mLmin1。1.7 数据统计分析 采用一级动力学模型和 Logistics动力学模型30对菲的降解动力学数据进行拟合:C/C0=exp(kt)(1)C/C0=1/(1+exp(k(lntc)(2)式中,C0和 C 分别为初始菲浓度和特定培养时间t(d)时体系中菲的残留浓度(m
19、gL1),k 为菲降解速率常数(d1),exp(c)为 Logistics 菲降解动力学的半衰期(d)。2 结 果 2.1 鞘脂菌 PHE3 在不同载体表面的附着 利用扫描电镜(SEM)对营养肉汤培养基中鞘脂菌 PHE3 在不同载体表面的负载情况进行表征(图 1)。鞘脂菌 PHE3 呈杆状或椭球状附着在载体表面,菌体大小约 0.51.5 m,菌形态完好。在玉米秸秆炭的表面可以清晰观察到大量细菌附着生长,排列紧密,有生物膜形成。同样在蒙脱石的表面及狭缝的微孔中也有较多的细菌定殖,负载效果较好。而在高岭石体系中,高岭石表现出团聚现象,仅有极少数的细菌附着在其表面。针铁矿呈现独特的针状结构,其表面负
20、载的菌也较少。简言之,鞘脂菌 PHE3 在玉米秸秆炭和蒙脱石载体表面附生效果较好,而在高岭石和针铁矿载体表面负载效果较差,这可能与载体本身的性质以及载体与细菌之间的静电作用等相互作用有关。图 1 营养肉汤培养基中培养 2 d后鞘脂菌 PHE3在不同载体表面负载的扫描电镜图 Fig.1 Scanning electron microscope results of Sphingobium sp.PHE3 on different carriers in nutrient broth medium after 2 days incubation 2.2 不同载体体系中鞘脂菌 PHE3 对菲的降解
21、根据载体筛选的扫描电镜结果(图 1),选择菌株负载效果较好的蒙脱石和玉米秸秆炭以及具有独特结构的针铁矿为载体,添加到菲的降解体系中。如图 2 所示,添加蒙脱石、玉米秸秆炭和针铁矿载体均能在一定程度上促进微生物对菲的降解。当菲初始浓度较低为 20 mgL1时,3 d 后添加和不添加载体的不接菌对照处理菲的非生物损失小于 10.9%(图 2a)。添加玉米秸秆生物炭的微生物降解体系中菲的降解速率最快,3 d 内降解率达到 68.3%(表 1)。同时,添加蒙脱石和针铁矿的微生物降解体系,3 d内菲的降解率分别为 54.8%和 49.5%,而未添加载体只接种菌的处理中菲的降解速率最低(图 2a)。一级动
22、力学模型可较好表征低浓度下菲的降解动力学(表 1),不同体系中菲的微生物降解速率常数从高到低依次为:添加玉米秸秆炭接菌处理、添加蒙脱石接菌处理、添加针铁矿接菌处理、只接菌处理。根据以上结果,菲的初始浓度增至 100 mgL11196 土 壤 学 报 60 卷 http:/ 时,选用对菲微生物降解促进作用较好的蒙脱石和玉米秸秆炭为载体,结果表明 5 d 后未添加以及添加载体的未接种对照处理的非生物损失在菲初始浓度的 9.2%以内(图 2b)。在菲降解初期第 1 天内,只接菌处理和添加蒙脱石的接菌处理中菲的降解比较缓慢,这可能是因为降解菌在接种到降解体系的最初一段时间内活性较低,处于迟滞适应阶段7
23、,31(图 2b)。未添加载体的接种处理在培养 3 d 后微生物降解率约为 63%,添加蒙脱石和玉米秸秆炭均显著提高了鞘脂菌 PHE3 对菲的降解效率。与只接种降解菌处理组相比,添加蒙脱石和玉米秸秆炭对菲的微生物降解率分别提高了 44%和 29%(表 1)。在菲降解后期,添加玉米秸秆炭的接菌处理对菲的降解增加变缓,降解率低于添加蒙脱石的接菌处理,这可能是由于随着菲残留浓度的降低,有限的碳源菲又被生物炭紧密吸附,进入生物炭的微孔结构中,微生物及其降解酶难以有效接触,导致其微生物可利用性降低32。5 d 内添加蒙脱石的接种处理几乎彻底降解体系中的菲,降解率高达 98.8%,这可能是由于蒙脱石较高的
24、比表面积刺激了菲的微生物降解11。所有接菌处理中菲的降解过程均可以用Logistics 降解动力学模型进行很好的拟合(表 1)。菲在添加蒙脱石体系中的微生物降解速率最高,为4.31 d1,其次是只接菌不添加载体的体系(3.52 d1),添加玉米秸秆炭体系的微生物降解速率较低。然而,只接菌体系和蒙脱石接菌体系中菲的微生物降解有1 d 的延迟,但在添加玉米秸秆炭的接菌体系中未观察到此现象(图 2b),说明高浓度的菲对降解菌活性有一定抑制33,而玉米秸秆炭对菲较强的吸附能力减弱了高浓度菲的毒性胁迫,这也导致了菲在玉米秸秆炭接菌处理中的降解半衰期最短,仅为1.62 d(表 1)。2.3 不同载体体系中
25、 EPS 的生成 胞外聚合物提取测定结果表明,随培养时间的增加,不同载体体系中 EPS 的多糖和蛋白质组分均表现出先增加后减少的趋势(图 3)。因为在培养初期,菲浓度较高,对于微生物来说碳源充足,降解菌生长繁殖较快,其分泌的 EPS 随之增加,随着培养时间增加,菲逐渐被降解而浓度降低,碳源受限,降解菌生长变缓,活性降低,其产生的 EPS 随之减少。与只接种降解菌的体系相比,添加蒙脱石和玉米秸秆炭明显增加细菌 EPS 的产生,而添加针铁矿对降解菌生成 EPS 的促进作用不明显,甚至出现抑制。菲初始浓度为 20 mgL1时,不同载体体系中降解菌产生的多糖在 1.5 d 后达最大值,其中只接菌体系中
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