苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家自然科学基金资助项目(21507064,21866024);内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2020MS02003);内蒙古自治区高校青年科技英才计划项目(NJYT-20-B01);内蒙古自治区高等学校创新团队发展计划支持项目(NMGIRT2321)第一作者:张继晔(1998),男,硕士研究生,研究方向为水生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.75
2、24/AJE.1673-5897.20221125001张继晔,黄莹,李志彤,等.苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性J.生态毒理学报,2023,18(3):285-295Zhang J Y,Huang Y,Li Z T,et al.Immunotoxicity of benzotriazole ultraviolet stabilizers in adult zebrafish(Danio rerio)J.Asian Journal of Ecotoxicol-?ogy,2023,18(3):285-295(in Chinese)苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性张继晔1,黄莹
3、1,李志彤1,2,梁雪芳1,*,陈辉辉3,查金苗21.内蒙古大学生态与环境学院,内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室,呼和浩特 0100212.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室,北京 1000853.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,南京 210008收稿日期:2022-11-25 录用日期:2023-01-07摘要:苯并三唑类紫外光稳定剂(benzotriazole ultraviolet stabilizers,BUVSs)是一类具有环境持久性、生物累积性和内分泌干扰效应的新兴污染物,在水环境和水生生物体内广泛检出。研究表明 BUVSs 可
4、引起免疫相关通路的分子响应,影响鱼类早期发育,然而目前不同结构 BUVSs 对成鱼的免疫毒性效应研究十分有限。因此,本文选取 4 种 BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329和 UV-P),在10 g L-1浓度下对斑马鱼成鱼暴露28 d,观察斑马鱼肠道组织的病理学变化,并测定肠道、肾脏和血液中免疫相关蛋白表达水平,以评估不同结构的 BUVSs 对斑马鱼成鱼的肠道和免疫的影响。结果表明,10 gL-1UV-234、UV-329 和UV-P 暴露能够引起斑马鱼成鱼肠道杯状细胞减少、黏液增多和肠绒毛高度减小。免疫相关蛋白在不同 BUVSs 暴露后的表达存在差异,且具有组织特异性。其中,
5、UV-234 和 UV-326 暴露后引起芳香烃受体 AhR 和白细胞介素 IL17/22 的显著变化,同时 UV-326、UV-329 和 UV-P 均可抑制细胞色素 P450 家族 CYP1A1 表达。综上,BUVSs 长期暴露能够引起斑马鱼成鱼肠道损伤并导致免疫毒性。关键词:苯并三唑紫外光稳定剂;斑马鱼;免疫毒性;芳香烃受体;肠道损伤文章编号:1673-5897(2023)3-285-11 中图分类号:X171.5 文献标识码:AImmunotoxicity of Benzotriazole Ultraviolet Stabilizers in Adult Zebrafish(Danio
6、 rerio)Zhang Jiye1,Huang Ying1,Li Zhitong1,2,Liang Xuefang1,*,Chen Huihui3,Zha Jinmiao21.Inner Mongolia Key Laboratory of Environmental Pollution Control&Waste Resource Reuse,School of Ecology and Environment,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China2.State Key Laboratory of Environmental Aquati
7、c Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy ofSciences,Beijing 100085,China3.State Key Laboratory of Lake Science and Environment,Nanjing Institute of Geography and Limnology,Chinese Academy of Sci-ences,Nanjing 210008,ChinaReceived 25 November 2022 accepted 7 January
8、2023Abstract:Benzotriazole ultraviolet stabilizers(BUVSs)are emerging pollutants with characteritics of environmen-286 生态毒理学报第 18 卷tal persistence,bioaccumulative potential and endocrine-disrupting effects.BUVSs have been widely detected in a-quatic ecosystem.It is reported that BUVSs can disrupt im
9、mune-related pathways and affect early development offish.However,the immunotoxicity of BUVSs congeners in adult fish is not well documented.In this study,adultzebrafish were exposed to 4 BUVSs(UV-234,UV-326,UV-329,and UV-P)at 10 g L-1for 28 d.Pathologicalchanges of intestine were analyzed and the l
10、evels of immune-related proteins in intestine,kidney,and serum weremeasured.The results showed that a decrease in goblet cell number and intestinal villi height,as well as the in-creased mucus were observed in the intestine of adult zebrafish exposed to 10 g L-1UV-234,UV-329 and UV-P.Moreover,the ex
11、pression of immune-related proteins was changed after BUVSs exposure with the tissue-depend-ent pattern.Specifically,significant alteration in protein levels of aryl hydrocarbon receptor(AhR)and interleukin(IL)17/22 was observed in UV-234 and UV-326 groups,while CYP1A1 expression was inhibited by UV
12、-326,UV-329 and UV-P.Overall,our findings indicated that chronic exposure to BUVSs can cause intestinal damageand lead to immunotoxicity in adult zebrafish.Keywords:benzotriazole ultraviolet stabilizers;zebrafish;immunotoxicity;AhR;intestinal damage 苯并三唑类紫外光稳定剂(benzotriazole ultravi-olet stabilizers
13、,BUVSs)因具有良好的紫外吸收能力以及抗氧化性能,被作为添加剂广泛应用于塑料制品和个人护理品中1-2。由于需求量大、生产量高,近年来在多种环境介质中被频繁检出3-4,成为一种新污染物,其在地表水中的浓度高达 2 419 ng L-1,在沉积物和污泥中的浓度高达 216.2 gg-12,5-8。BUVSs 亲脂性较高,其辛醇水分配系数(logKow)为?4.31 7.67,具有生物富集性9。此外,BUVSs 具有潜在的环境持久性,其在环境中的半衰期为 75 328 d3,10-11。在沿食物链放大和生物转化的过程中,BUVSs 可能对鱼类等高等水生生物产生较高的暴露风险和毒性效应12。已有研
14、究报道 BUVSs 可通过影响水生生物的抗氧化系统,引起氧化损伤13-15。同时,体内和体外实验表明 BUVSs 具有配体活性,能与雌激素受体(estrogen receptor,ER)、雄激素受体(androgen recep-tor,AR)和芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)等多种核激素受体结合,具有内分泌干扰效应16-17。Liang 等18评估了 4 种 BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329 和 UV-P)在 1、10 和 100 gL-1暴露 96 h 后对斑马鱼胚胎的毒性效应,观察到甲状腺激素受体基因的转录水平受到影响,表明 B
15、UVSs 可能通过影响斑马鱼胚胎甲状腺系统导致内分泌失衡。Fent 等19将斑马鱼胚胎分别暴露于 16 gL-1和 690 g L-1的 UV-P 和 UV-326 中 6 d 后,发现代谢相关基因(ahr1、arnt2、cyp1a1和gstp1)表达具有显?著变化,在 690 g L-1的浓度下具有较高的抗雄激素活性,其结果揭示了 BUVSs 暴露导致斑马鱼代谢稳态失衡和发育毒性。鱼类的内分泌系统主要通过下丘脑-垂体控制的相关作用轴调控各种生理功能,从而影响鱼类的生长发育和代谢20。具有内分泌干扰效应的外源化合物能够激活鱼类体内激素受体信号通路,诱导免疫细胞增殖或功能损伤,从而导致免疫刺激或
16、免疫抑制21-22。近年来,已有研究报道了BUVSs 对斑马鱼早期发育阶段的免疫毒性。如 Li-ang 等23发现斑马鱼胚胎分别暴露于 0.01、0.1和 1 mol L-1的 UV-234 和 UV-320 中 6 d 后,免疫细胞因子il8和cxcl-C1c的基因表达显著抑制,且斑马鱼胚胎发育、运动行为和线粒体生物能均受到不同程度的干扰。李雯镜24比较了 4 种 BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329 和 UV-P)对斑马鱼幼鱼转录组的影响,结果发现暴露28 d 后,4 种 BUVSs 共同影响斑马鱼的免疫系统相关通路。同时,在10 g L-1和 100 g L-1浓度下斑马
17、鱼仔鱼 AhR-IL17/IL22 介导的免疫通路相关分子受到显著影响25。这些研究表明,BU-VSs 可能通过干扰斑马鱼先天免疫系统引起免疫毒性。然而,目前对 BUVSs 免疫毒性的研究主要集中于免疫相关因子的基因表达水平,同时,由于斑马鱼早期发育阶段只有先天免疫,并不具备成熟的获得性免疫,因此,BUVSs 长期暴露能否干扰斑马鱼成鱼的免疫系统并产生不利影响,需进一步研究。因此,为了探究不同结构的 BUVSs 对斑马鱼成鱼的免疫毒性,将斑马鱼成鱼暴露于4 种典型BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329 和 UV-P)中28 d,首先通过组织病理学观察初步判别 BUVSs 长期暴露
18、对斑马鱼成鱼肠道组织的影响,然后测定不同免疫器官(肠道、肾脏和血液)中芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,第 3 期张继晔等:苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性287 AhR)介导的免疫通路相关因子的含量,评估不同结构 BUVSs 对斑马鱼成鱼的免疫毒性效应。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 实验动物野生 AB 型斑马鱼购自商业公司(一树梨花,南京,中国)并饲养于实验室流水养殖系统内(Z-A-S5,海圣,上海)。养殖系统的光/暗周期设置为 14 h 10h。控制养殖水条件:水温(281),pH 7.20.1,溶解氧(8.00
19、.5)mg L-1,电导率为(50050)S cm-1。每天投喂丰年虾活体(Artemia naupli),同时清除系?统内的食物残渣和粪便。1.2 试剂UV-234(CAS 号 70321-86-7;纯度99%)、UV-326(CAS 号 3896-11-5;纯度99%)、UV-329(CAS 号3147-75-9;纯度99%)和 UV-P(CAS 号2440-224;纯度99%)均购自美国百灵威(J&K)化工有限公司;内标 Allyl-bzt(2-(3-allyl-2-hydroxy-5-methylphenyl)-benzotriazole,2-(3-烯丙基-2-羟基-5-甲基苯基)-2
20、H-苯并噻唑,CAS 号 2170-39-0,纯度98%)购自 TCI;斑马 鱼 白 细 胞 介 素 IL-17A、IL-22、细 胞 色 素P4501A1(CYP1A1)、芳香烃受体(AhR)、免疫球蛋白Ig-M、Ig-G 酶联免疫吸附分析试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司(中国)。液相色谱级甲醇、二氯甲烷由默克公司(Merck,德国)提供。1.3 实验方法1.3.1 暴露液配制基于 Li 等25对 4 种 BUVSs 暴露后斑马鱼幼鱼免疫毒性的研究和李雯镜等3对苯并三唑类紫外稳定剂在环境中的检测和分布等调查,选取10 g L-1为暴露浓度。以 DMSO 为助溶剂制备10 mg L-1的各 B
21、UVSs 储备液。暴露实验开始前按照 1 mL BU-VSs 储备液1 L 养殖水的比例加入相应体积的 BU-VSs 储备液,使暴露溶液的终浓度为 10 g L-1BU-VSs。实验以 0.1%DMSO(VV=11 000)作为溶?剂对照组。1.3.2 斑马鱼成鱼暴露暴露实验前,斑马鱼(3 月鱼龄,野生 AB 型)已在养殖系统中驯化 2 周,随机挑选健康成鱼并分别置于 15 个 3 L 烧杯中,每个烧杯 15 条鱼。以含0.1%DMSO 的溶液为空白对照,10 gL-1的 4 种BUVSs 为暴露组,共 5 个处理组,每个处理组设置 3个平行(n=3)。进行 28 d 半静态暴露,每天更新?9
22、0%的暴露液,暴露期间斑马鱼养殖条件与驯化期间相同,暴露结束前 1 d 不再投喂。将斑马鱼成鱼置于冰上麻醉并解剖,用肝素钠浸泡过的毛细管进行尾部取血,取每 10 条鱼的血液混合为一个生物样本,每个处理组 3 个生物学重复(n=3)。每个处理组?各取 3 条鱼的肠道,立即放入组织固定液以便进行后续组织病理学分析(n=3)。每个烧杯中,收集 5 条?鱼的肠道或肾脏组织作为一个生物学样本,每个处理组 3 个生物学重复(n=3),组织样本用液氮速冻并?在-80 保存以用于后续的酶活分析。1.3.3 暴露液浓度测定化合 物 浓 度 分 析 测 定 参 照 文 献 报 道 的 方法2-3,26。暴露期间于
23、 4 个不同时间点,从每个处理组(n=3)中分别采集 250 mL 水样(暴露液更新后取?样,-20 避光保存),将 4 次采集的暴露液混合为 1L,加入内标 Allyl-bzt 使其在待处理水样中浓度为10 g L-1。水样经 0.22 m 的玻璃纤维滤膜(What-man,英国)过滤后用固相萃取柱(HLB,Waters,美国)进行富集。HLB 柱使用前依次加入 6 mL 二氯甲烷,6 mL 甲醇和6 mL 纯水进行活化,活化后水样以10 mL min-1流速经过 HLB 柱,再用6 mL 纯水润洗HLB 柱,真空干燥 30 min。分别用 2 mL 甲醇/二氯甲烷(VV=11)溶液洗脱 3
24、 次,共收集 6 mL 洗脱?液至玻璃试管中,然后用高纯度氮气吹干。管中加入 1 mL 甲醇复溶,转移至检测瓶使用超高效液相质谱联用仪(ACQUITY H-class UPLC;Xevo TQD,美国)分析。色谱柱为 Shim-Pack Scepter C18(4.6mm 50 mm,3 m,SHIMADZU)。检测条件见表1,采用内标法进行定量分析。1.3.4 组织病理学观察肠道组织置于 4%多聚甲醛固定液中固定,乙醇中脱水后进行石蜡包埋。制成厚度为 4 m 的切片,用苏木精和伊红染色(H&E 染色)。在显微镜下(Olympus SZX2-ILLB,日本)随机选取 3 个视野镜检并拍照。组织
25、损伤半定量分析使用 ImageJ 图像处理软件进行,首先对拍摄的图像进行灰度处理,然后使用 ImageJ 的计数功能对每张图像中观察到的杯状细胞进行计数,并使用 ImageJ 的测量功能计算不同处理组肠道组织中黏液量(占肠道组织区域面积的百分比)、肠绒毛高度和肌层厚度(n=9)。以平均?数差异显著性 T 检验,判断肠道损伤情况,P 0.05?表示具有统计学意义。1.3.5 酶联免疫吸附测定取适量组织样本放置在 1.5 mL 离心管中,按照288 生态毒理学报第 18 卷质量(g)体积(mL)=19 的比例,将 PBS(1)添加到不同组织样本(肠道、肾脏和血液)中,随后将样品放置在冰上进行匀浆,
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