苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家自然科学基金资助项目(21507064,21866024);内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2020MS02003);内蒙古自治区高校青年科技英才计划项目(NJYT-20-B01);内蒙古自治区高等学校创新团队发展计划支持项目(NMGIRT2321)第一作者:张继晔(1998),男,硕士研究生,研究方向为水生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221125001张继晔,黄莹,李志彤,等.苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性J.生态毒理学报,2023,18(3):285-295Zhang J Y,Huang Y,Li Z T,et al.Immunotoxicity of benzotriazole ultraviolet stabilizers in adult zebrafish(Danio rerio)J.Asian Journal of Ecotoxicol-?ogy,2023,18(3):285-295(in Chinese)苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性张继晔1,黄莹1,李志彤1,2,梁雪芳1,*,陈辉辉3,查金苗21.内蒙古大学生态与环境学院,内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室,呼和浩特 0100212.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室,北京 1000853.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,南京 210008收稿日期:2022-11-25 录用日期:2023-01-07摘要:苯并三唑类紫外光稳定剂(benzotriazole ultraviolet stabilizers,BUVSs)是一类具有环境持久性、生物累积性和内分泌干扰效应的新兴污染物,在水环境和水生生物体内广泛检出。研究表明 BUVSs 可引起免疫相关通路的分子响应,影响鱼类早期发育,然而目前不同结构 BUVSs 对成鱼的免疫毒性效应研究十分有限。因此,本文选取 4 种 BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329和 UV-P),在10 g L-1浓度下对斑马鱼成鱼暴露28 d,观察斑马鱼肠道组织的病理学变化,并测定肠道、肾脏和血液中免疫相关蛋白表达水平,以评估不同结构的 BUVSs 对斑马鱼成鱼的肠道和免疫的影响。结果表明,10 gL-1UV-234、UV-329 和UV-P 暴露能够引起斑马鱼成鱼肠道杯状细胞减少、黏液增多和肠绒毛高度减小。免疫相关蛋白在不同 BUVSs 暴露后的表达存在差异,且具有组织特异性。其中,UV-234 和 UV-326 暴露后引起芳香烃受体 AhR 和白细胞介素 IL17/22 的显著变化,同时 UV-326、UV-329 和 UV-P 均可抑制细胞色素 P450 家族 CYP1A1 表达。综上,BUVSs 长期暴露能够引起斑马鱼成鱼肠道损伤并导致免疫毒性。关键词:苯并三唑紫外光稳定剂;斑马鱼;免疫毒性;芳香烃受体;肠道损伤文章编号:1673-5897(2023)3-285-11 中图分类号:X171.5 文献标识码:AImmunotoxicity of Benzotriazole Ultraviolet Stabilizers in Adult Zebrafish(Danio rerio)Zhang Jiye1,Huang Ying1,Li Zhitong1,2,Liang Xuefang1,*,Chen Huihui3,Zha Jinmiao21.Inner Mongolia Key Laboratory of Environmental Pollution Control&Waste Resource Reuse,School of Ecology and Environment,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy ofSciences,Beijing 100085,China3.State Key Laboratory of Lake Science and Environment,Nanjing Institute of Geography and Limnology,Chinese Academy of Sci-ences,Nanjing 210008,ChinaReceived 25 November 2022 accepted 7 January 2023Abstract:Benzotriazole ultraviolet stabilizers(BUVSs)are emerging pollutants with characteritics of environmen-286 生态毒理学报第 18 卷tal persistence,bioaccumulative potential and endocrine-disrupting effects.BUVSs have been widely detected in a-quatic ecosystem.It is reported that BUVSs can disrupt immune-related pathways and affect early development offish.However,the immunotoxicity of BUVSs congeners in adult fish is not well documented.In this study,adultzebrafish were exposed to 4 BUVSs(UV-234,UV-326,UV-329,and UV-P)at 10 g L-1for 28 d.Pathologicalchanges of intestine were analyzed and the levels of immune-related proteins in intestine,kidney,and serum weremeasured.The results showed that a decrease in goblet cell number and intestinal villi height,as well as the in-creased mucus were observed in the intestine of adult zebrafish exposed to 10 g L-1UV-234,UV-329 and UV-P.Moreover,the expression of immune-related proteins was changed after BUVSs exposure with the tissue-depend-ent pattern.Specifically,significant alteration in protein levels of aryl hydrocarbon receptor(AhR)and interleukin(IL)17/22 was observed in UV-234 and UV-326 groups,while CYP1A1 expression was inhibited by UV-326,UV-329 and UV-P.Overall,our findings indicated that chronic exposure to BUVSs can cause intestinal damageand lead to immunotoxicity in adult zebrafish.Keywords:benzotriazole ultraviolet stabilizers;zebrafish;immunotoxicity;AhR;intestinal damage 苯并三唑类紫外光稳定剂(benzotriazole ultravi-olet stabilizers,BUVSs)因具有良好的紫外吸收能力以及抗氧化性能,被作为添加剂广泛应用于塑料制品和个人护理品中1-2。由于需求量大、生产量高,近年来在多种环境介质中被频繁检出3-4,成为一种新污染物,其在地表水中的浓度高达 2 419 ng L-1,在沉积物和污泥中的浓度高达 216.2 gg-12,5-8。BUVSs 亲脂性较高,其辛醇水分配系数(logKow)为?4.31 7.67,具有生物富集性9。此外,BUVSs 具有潜在的环境持久性,其在环境中的半衰期为 75 328 d3,10-11。在沿食物链放大和生物转化的过程中,BUVSs 可能对鱼类等高等水生生物产生较高的暴露风险和毒性效应12。已有研究报道 BUVSs 可通过影响水生生物的抗氧化系统,引起氧化损伤13-15。同时,体内和体外实验表明 BUVSs 具有配体活性,能与雌激素受体(estrogen receptor,ER)、雄激素受体(androgen recep-tor,AR)和芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)等多种核激素受体结合,具有内分泌干扰效应16-17。Liang 等18评估了 4 种 BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329 和 UV-P)在 1、10 和 100 gL-1暴露 96 h 后对斑马鱼胚胎的毒性效应,观察到甲状腺激素受体基因的转录水平受到影响,表明 BUVSs 可能通过影响斑马鱼胚胎甲状腺系统导致内分泌失衡。Fent 等19将斑马鱼胚胎分别暴露于 16 gL-1和 690 g L-1的 UV-P 和 UV-326 中 6 d 后,发现代谢相关基因(ahr1、arnt2、cyp1a1和gstp1)表达具有显?著变化,在 690 g L-1的浓度下具有较高的抗雄激素活性,其结果揭示了 BUVSs 暴露导致斑马鱼代谢稳态失衡和发育毒性。鱼类的内分泌系统主要通过下丘脑-垂体控制的相关作用轴调控各种生理功能,从而影响鱼类的生长发育和代谢20。具有内分泌干扰效应的外源化合物能够激活鱼类体内激素受体信号通路,诱导免疫细胞增殖或功能损伤,从而导致免疫刺激或免疫抑制21-22。近年来,已有研究报道了BUVSs 对斑马鱼早期发育阶段的免疫毒性。如 Li-ang 等23发现斑马鱼胚胎分别暴露于 0.01、0.1和 1 mol L-1的 UV-234 和 UV-320 中 6 d 后,免疫细胞因子il8和cxcl-C1c的基因表达显著抑制,且斑马鱼胚胎发育、运动行为和线粒体生物能均受到不同程度的干扰。李雯镜24比较了 4 种 BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329 和 UV-P)对斑马鱼幼鱼转录组的影响,结果发现暴露28 d 后,4 种 BUVSs 共同影响斑马鱼的免疫系统相关通路。同时,在10 g L-1和 100 g L-1浓度下斑马鱼仔鱼 AhR-IL17/IL22 介导的免疫通路相关分子受到显著影响25。这些研究表明,BU-VSs 可能通过干扰斑马鱼先天免疫系统引起免疫毒性。然而,目前对 BUVSs 免疫毒性的研究主要集中于免疫相关因子的基因表达水平,同时,由于斑马鱼早期发育阶段只有先天免疫,并不具备成熟的获得性免疫,因此,BUVSs 长期暴露能否干扰斑马鱼成鱼的免疫系统并产生不利影响,需进一步研究。因此,为了探究不同结构的 BUVSs 对斑马鱼成鱼的免疫毒性,将斑马鱼成鱼暴露于4 种典型BUVSs(UV-234、UV-326、UV-329 和 UV-P)中28 d,首先通过组织病理学观察初步判别 BUVSs 长期暴露对斑马鱼成鱼肠道组织的影响,然后测定不同免疫器官(肠道、肾脏和血液)中芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,第 3 期张继晔等:苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性287 AhR)介导的免疫通路相关因子的含量,评估不同结构 BUVSs 对斑马鱼成鱼的免疫毒性效应。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 实验动物野生 AB 型斑马鱼购自商业公司(一树梨花,南京,中国)并饲养于实验室流水养殖系统内(Z-A-S5,海圣,上海)。养殖系统的光/暗周期设置为 14 h 10h。控制养殖水条件:水温(281),pH 7.20.1,溶解氧(8.00.5)mg L-1,电导率为(50050)S cm-1。每天投喂丰年虾活体(Artemia naupli),同时清除系?统内的食物残渣和粪便。1.2 试剂UV-234(CAS 号 70321-86-7;纯度99%)、UV-326(CAS 号 3896-11-5;纯度99%)、UV-329(CAS 号3147-75-9;纯度99%)和 UV-P(CAS 号2440-224;纯度99%)均购自美国百灵威(J&K)化工有限公司;内标 Allyl-bzt(2-(3-allyl-2-hydroxy-5-methylphenyl)-benzotriazole,2-(3-烯丙基-2-羟基-5-甲基苯基)-2H-苯并噻唑,CAS 号 2170-39-0,纯度98%)购自 TCI;斑马 鱼 白 细 胞 介 素 IL-17A、IL-22、细 胞 色 素P4501A1(CYP1A1)、芳香烃受体(AhR)、免疫球蛋白Ig-M、Ig-G 酶联免疫吸附分析试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司(中国)。液相色谱级甲醇、二氯甲烷由默克公司(Merck,德国)提供。1.3 实验方法1.3.1 暴露液配制基于 Li 等25对 4 种 BUVSs 暴露后斑马鱼幼鱼免疫毒性的研究和李雯镜等3对苯并三唑类紫外稳定剂在环境中的检测和分布等调查,选取10 g L-1为暴露浓度。以 DMSO 为助溶剂制备10 mg L-1的各 BUVSs 储备液。暴露实验开始前按照 1 mL BU-VSs 储备液1 L 养殖水的比例加入相应体积的 BU-VSs 储备液,使暴露溶液的终浓度为 10 g L-1BU-VSs。实验以 0.1%DMSO(VV=11 000)作为溶?剂对照组。1.3.2 斑马鱼成鱼暴露暴露实验前,斑马鱼(3 月鱼龄,野生 AB 型)已在养殖系统中驯化 2 周,随机挑选健康成鱼并分别置于 15 个 3 L 烧杯中,每个烧杯 15 条鱼。以含0.1%DMSO 的溶液为空白对照,10 gL-1的 4 种BUVSs 为暴露组,共 5 个处理组,每个处理组设置 3个平行(n=3)。进行 28 d 半静态暴露,每天更新?90%的暴露液,暴露期间斑马鱼养殖条件与驯化期间相同,暴露结束前 1 d 不再投喂。将斑马鱼成鱼置于冰上麻醉并解剖,用肝素钠浸泡过的毛细管进行尾部取血,取每 10 条鱼的血液混合为一个生物样本,每个处理组 3 个生物学重复(n=3)。每个处理组?各取 3 条鱼的肠道,立即放入组织固定液以便进行后续组织病理学分析(n=3)。每个烧杯中,收集 5 条?鱼的肠道或肾脏组织作为一个生物学样本,每个处理组 3 个生物学重复(n=3),组织样本用液氮速冻并?在-80 保存以用于后续的酶活分析。1.3.3 暴露液浓度测定化合 物 浓 度 分 析 测 定 参 照 文 献 报 道 的 方法2-3,26。暴露期间于 4 个不同时间点,从每个处理组(n=3)中分别采集 250 mL 水样(暴露液更新后取?样,-20 避光保存),将 4 次采集的暴露液混合为 1L,加入内标 Allyl-bzt 使其在待处理水样中浓度为10 g L-1。水样经 0.22 m 的玻璃纤维滤膜(What-man,英国)过滤后用固相萃取柱(HLB,Waters,美国)进行富集。HLB 柱使用前依次加入 6 mL 二氯甲烷,6 mL 甲醇和6 mL 纯水进行活化,活化后水样以10 mL min-1流速经过 HLB 柱,再用6 mL 纯水润洗HLB 柱,真空干燥 30 min。分别用 2 mL 甲醇/二氯甲烷(VV=11)溶液洗脱 3 次,共收集 6 mL 洗脱?液至玻璃试管中,然后用高纯度氮气吹干。管中加入 1 mL 甲醇复溶,转移至检测瓶使用超高效液相质谱联用仪(ACQUITY H-class UPLC;Xevo TQD,美国)分析。色谱柱为 Shim-Pack Scepter C18(4.6mm 50 mm,3 m,SHIMADZU)。检测条件见表1,采用内标法进行定量分析。1.3.4 组织病理学观察肠道组织置于 4%多聚甲醛固定液中固定,乙醇中脱水后进行石蜡包埋。制成厚度为 4 m 的切片,用苏木精和伊红染色(H&E 染色)。在显微镜下(Olympus SZX2-ILLB,日本)随机选取 3 个视野镜检并拍照。组织损伤半定量分析使用 ImageJ 图像处理软件进行,首先对拍摄的图像进行灰度处理,然后使用 ImageJ 的计数功能对每张图像中观察到的杯状细胞进行计数,并使用 ImageJ 的测量功能计算不同处理组肠道组织中黏液量(占肠道组织区域面积的百分比)、肠绒毛高度和肌层厚度(n=9)。以平均?数差异显著性 T 检验,判断肠道损伤情况,P 0.05?表示具有统计学意义。1.3.5 酶联免疫吸附测定取适量组织样本放置在 1.5 mL 离心管中,按照288 生态毒理学报第 18 卷质量(g)体积(mL)=19 的比例,将 PBS(1)添加到不同组织样本(肠道、肾脏和血液)中,随后将样品放置在冰上进行匀浆,随后于 4、2 500 r min-1条件下离心 10 min,取上清液用于 ELISA 酶活测试。根据试剂盒说明书测定样本的总蛋白含量、AhR 含量、CYP1A1 活性、IL17A、IL22、Ig-G 和 Ig-M 含量。各蛋白的检出限分别为 AhR(25 800 pgmL-1)、CYP1A1(3 150 IUL-1)、IL17A(0.25 9 ngL-1)、IL22(1 40 ng L-1)、Ig-G(1 32 gmL-1)和 Ig-M(0.1 3.5 g mL-1)。每个平行组之间的平均变异系数和板内变异系数的平均值分别为10%和12%。1.4 数据分析使用 GraphPad Prism 9 进行统计学分析。采用Kolmogorov-Smirnov 和 Levene 检验分别验证数据正态性和方差齐性,数据分析采用 ANOVA 单因素方差分析和 Holm-Sidak 多重比较试验。定量数据表示为平均值标准误差(meanSEM),P370.2,1.001 1.135 min)、UV-326(316.3 260.1,0.702 0.902 min)、UV-329(324.2212.1,1.838 1.905 min)和 UV-P(225.9 120.0,0.602 0.668 min),如图1 所示,方法检出限、定量限分别为 UV-234(0.25 gL-1,0.75 gL-1)、UV-326(0.57 gL-1,1.70 gL-1)、UV-329(0.35 gL-1,0.92 g L-1)和 UV-P(0.61 g L-1,1.25 g L-1)。每个处理组检测到的暴露液浓度如表 2 所示,由于实际浓度与名义浓度接近(误差20%),因此下文以BUVSs 的名义浓度作为暴露浓度。2.2 BUVSs 破坏斑马鱼成鱼的肠道屏障在 28 d 暴露实验期间,斑马鱼成鱼的死亡率和畸形率均无显著变化。然而,10 g L-1的 4 种 BU-VSs 暴露后,斑马鱼肠道均出现不同程度的损伤,包括杯状细胞数量减少、肠道黏液增多、肠绒毛部分脱落以及肠绒毛高度降低等(图 2)。在 UV-234 处理组中,杯状细胞数量减少36%(F(4,40)=28.23,P0.0001)?(图 2(b)和图 3(a),黏液量增加 46.8%(F(4,40)=16.27,?P0.0001)(图 2(b)和图 3(d);在 UV-326 暴露组中,?部分肠绒毛出现组织溶解现象(图 2(c);而在 UV-329 和 UV-P 处理组中,肠绒毛平均高度均显著降低,分别由 32.9 m 降低到 24.69 m(F(4,40)=17.18,?P0.0001)和 24.86 m(F(4,40)=17.18,P0.0001)(图 2?(d)和图2(e),图3(b)。这些结果表明4 种 BUVSs 均能破坏斑马鱼肠道屏障。表 1 UPLC-MS 检测条件Table 1Test conditions of UPLC-MS检测条件Test conditions条件设置Condition settings柱温 Column temperature40 进样量 Sample size5 L流速 Flow rate0.4 mL min-1流动相 A Mobile phase A0.1%甲酸水溶液 0.1%formic acid solution流动相 B Mobile phase B乙腈 Acetonitrile洗脱程序 Elution procedure0 0.5 min,60%B;0.5 4 min,60%100%B;4 5 min,100%B;5 5.1 min,60%B电喷雾离子源 Electrospray ion source正离子模式检测 Electron spray ionization+(ESI+)ESI+毛细管电压 ESI+capillary voltage3.5 kV离子源温度 Ion source temperature100 脱溶剂温度 Temperature of desolvent350 脱溶剂气流量 Desolvent gas flow rate650 L h-1碰撞气 Collision Gas氩气 Argon检测方式 Detection method多反应监测 Multiple response monitoring(MRM)第 3 期张继晔等:苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性289 图 1 苯并三唑类紫外光稳定剂(BUVSs)离子对和出峰时间注:(a)UV-234;(b)UV-326;(c)UV-329;(d)UV-P。Fig.1 Ion-pair and peak emergence time of benzotriazole ultraviolet stabilizers(BUVSs)Note:(a)UV-234;(b)UV-326;(c)UV-329;(d)UV-P.2.3 BUVSs 对斑马鱼免疫相关蛋白的影响为了进一步研究 BUVSs 对斑马鱼成鱼的免疫毒性,选 取 6 个 免 疫 相 关 蛋 白(IL-17A、IL-22、CYP1A1、AhR、Ig-G 和 Ig-M)进行 ELISA 酶活测试。结果显示,暴露 28 d 后,不同结构的 BUVSs 处理组中 AhR、CYP1A1、IL-17A 和 IL-22 的表达出现显著差异,同时呈现组织特异性(图 4)。在肠道中,UV-234 和 UV-326 处理组中 AhR 的表达量分别上调 1.5 倍(F(4,10)=7.66,P=0.05)和 1.53 倍(F(4,10)=?7.66,P=0.04),而 UV-329 和 UV-P 暴露组无显著差?异(图 4(a)。另外,IL-22 在 UV-234 和 UV-P 暴露后分别增加1.75 倍(F(4,10)=3.86,P=0.04)和1.85 倍(F(4,10)?=3.86,P=0.02),而其他2 个处理组无变化(图4(d)。在肾脏中,除 UV-234 外,UV-326、UV-329 和UV-P 暴露组中 CYP1A1 的活性均受到显著抑制,分别下降了 1.26 倍(F(4,10)=23.65,P=0.01)、1.44 倍?(F(4,10)=23.65,P=0.0006)和 1.58 倍(F(4,10)=23.65,P=?0.0002)(图 3(f)。同时,UV-326 暴露后,IL-17A 表达量显著上调1.42 倍(F(4,10)=5.23,P=0.02)(图4(g)。4 种 BUVSs 暴露后血液中 Ig-M 含量均无显著变化(图4(i),仅在 UV-P 暴露组中检测到 Ig-G 含量显著上调 1.35 倍(F(4,10)=13.59,P=0.0005)(图 4(j)。表 2 BUVSs 暴露液实际浓度Table 2 BUVSs concentration measured in the exposure solutions条件ConditionsControlUV-234UV-326UV-329UV-P名义浓度/(g L-1)Nominal concentration/(g L-1)010101010实际浓度/(g L-1)Measured concentration/(g L-1)ND9.730.219.180.579.670.838.470.39注:ND 表示未检测出;数据以平均值标准偏差表示。Note:ND stands for not detected;the data are expressed as meansstandard deviations.290 生态毒理学报第 18 卷图 2 BUVSs 对斑马鱼成鱼肠道的组织病理学分析注:(a)0.1%DMSO,(b)10 g L-1UV-234,(c)10 g L-1UV-326,(d)10 g L-1UV-329,(e)10 g L-1UV-P;黑色箭头表示杯状细胞,红色箭头表示肠道黏液,黄色双向箭头表示肠绒毛高度,蓝色圆圈表示肠绒毛溶解;比例尺为 20 m。Fig.2 Histological analysis of the intestine of adult zebrafish following BUVSs exposureNote:(a)0.1%DMSO,(b)10 g L-1UV-234,(c)10 g L-1UV-326,(d)10 g L-1UV-329,(e)10 g L-1UV-P;black arrows indicate the goblet cell;red arrow indicates the mucus;yellow arrows indicate the villus height;blue circles indicate damaged and partially dissolved villi;scale bar is 20 m.图 3 10 g L-1BUVSs 暴露对肠道组织表型指标水平影响注:(a)杯状细胞数目,(b)肠绒毛高度,(c)肠肌层厚度,(d)黏液占肠切面百分比;所有定量数据均以平均数SEM 表示;*表示暴露组和对照组之间有显著差异(P0.05)。Fig.3 Semi-quantitation of histological changes in intestines of adult zebrafish following 10 g L-1BUVSs exposureNote:(a)Number of goblet cells,(b)intestinal villus height,(c)muscle thickness,(d)percentage of mucus in intestinal section;all quantitativedata are expressed as meanSEM;the asterisk(*)indicates a significant difference between treatments and controls(*P0.05).第 3 期张继晔等:苯并三唑紫外光稳定剂对斑马鱼成鱼的免疫毒性291 图 4 10 g L-1BUVSs 暴露对斑马鱼肠道、肾脏组织和血液免疫相关蛋白表达的影响注:测试指标包括 AhR、CYP1A1、IL-17A 和 IL-22 分别在肠道组织中(a)(d)和肾脏组织(e)(h)中的含量或活性,以及血液中(i)Ig-M和(j)Ig-G 的含量;数据以平均值标准误差表示;*表示实验组与对照组之间有显著性差异(*P0.05)。Fig.4 Effects of 10 g L-1BUVSs exposures on the levels of proteins related to immune responseNote:The biomarkers included the content or activity of AhR,CYP1A1,IL-17A,and IL-22 in intestine(a)(d)and kidney(e)(h),as well as the content of(i)Ig-M and(j)Ig-G in serum;the data are expressed as meanSEM,and asterisk denotes significant differences(*P 0.05)between treatments and controls.3 讨论(Discussion)鱼类肠道是抵抗复杂外部环境压力和病原微生物的最大免疫界面27,同时也是外源性化合物进入鱼体的重要途径28。肠道表面的微绒毛显著增加了肠道表面积,有利于营养物质的吸收和肠道微生物的附着,同时,肠绒毛强烈而规律的运动有助于阻止有害细菌定植。鱼类肠道中的杯状细胞可分泌黏蛋白,是黏液细胞的主要类型29。杯状细胞和分泌的黏液在抵抗病原微生物入侵和保护肠黏膜免受损伤等方面起着重要作用30。本研究中,在 10 gL-1BUVSs 暴露后,斑马鱼成鱼的肠道组织出现杯状细胞减少、黏液增加和肠绒毛高度下降等现象。与本研究结果类似,Jin 等30发现斑马鱼成鱼暴露于1 000 g L-1的直径 50 m 的球形聚苯乙烯微塑料(microplastics,MP)14 d 后,出现肠道中杯状细胞减292 生态毒理学报第 18 卷少和肠腔黏液体积增加的现象,并诱导肠道微生物群失调且诱发肠道炎症反应。Huang 等31用将斑马鱼成鱼分别暴露于1 mol L-1PFOS(perfluorooctanesulfonate)、F-53B(6:2 chlorinated polyfluorinated ethersulfonate,6:2 Cl-PFAES)和 OBS(sodium p-perfluorousnonenoxybenzene sulfonate)中 21 d,发现 3 种 PFAS(per-and polyfluoroalkyl substances)暴露后均降低斑马鱼成鱼肠绒毛高度,F-53B 和 OBS 处理组更具有显著性,同时观察到头肾形态改变和肠道微生物群失调,提示 PFAS 具有免疫毒性作用。本研究中,肠道组织学分析结果表明斑马鱼成鱼肠道组织可能是BUVSs 毒性的靶标,BUVSs 暴露能够引起斑马鱼成鱼肠道损伤,可能干扰肠道屏障功能和免疫稳态。肠道受到感染或损伤时,机体启动免疫应答机制,激活免疫效应细胞并分泌促炎和抗炎细胞因子,通过炎症反应介导细胞凋亡以清除外来有害物质并修复受损细胞和组织32-33。细胞因子是免疫系统中细胞间相互作用的信号分子,与细胞膜上受体结合后发挥多种生物效应,在免疫应答、免疫调节和炎症反应中发挥重要作用34。很多环境污染物具有免疫毒性,长期暴露后可干扰细胞因子及其相关的生物学通路,导致炎症反应异常或慢性免疫抑制,从而导致免疫失衡31,35-37。已有研究报道,BUVSs 对 AhR具有显著的配体活性38,并可激活斑马鱼的 AhR 通路19。笔者先前的研究也表明不同结构的 BUVSs均能干扰斑马鱼胚胎和幼鱼免疫相关通路,可能作用于 AhR-IL17/22 通路并诱导肝脏损伤25,39。上述研究均表明 AhR 介导的细胞因子途径可能是 BU-VSs 暴露后的免疫毒性机制。AhR 是炎症反应中调节组织稳态的关键因子40-41,AhR 信号被激活后,通过促炎因子直接或间接参与转录调控,以维持免疫屏障和控制炎症反应42。而在 AhR 信号通路调节过程中,CYP1 类酶,特别是 CYP1A1 参与生理性AhR 配体的降解,提供自动调节反馈机制,终止AhR 信号传导并防止外源性物质诱导的免疫抑制43。有研究发现,通过腹腔注射将青鳉鱼(Oryziaslatipes)暴露于2 g g-1(以体质量计)苯并a蒽(benzoapyrene,BaP)后,CYP1A 活性受到显著诱导,免疫细胞数量增加,结果表明 BaP 诱导的免疫毒性依赖于 AhR 通路的激活或 CYP1A 介导,而由于苯并e芘(benzoepyrene,BeP)不具 AhR 配体亲和力,因此不能激活 AhR 通路,未诱导 CYP1A 活性变化且未影响青鳉鱼的免疫功能44。本研究中 10 gL-1UV-234 和 UV-326 暴露均增加了斑马鱼成鱼肠道中 AhR 蛋白的表达,表明 UV-234 和 UV-326 可能通过 AhR 途径影响肠道免疫。同时,除 UV-234 外,其他 3 种 BUVSs 均抑制了斑马鱼肾脏中 CYP1A1的表达,这表明 UV-326 可能通过影响 AhR-CYP1A1的相互作用调节斑马鱼免疫系统,而 UV-329 和 UV-P 可能通过影响 CYP1A1 干扰免疫响应。白细胞介素是一种参与免疫调节和炎症反应的细胞因子,AhR 信号的激活可诱导 Th17 细胞的分化,产生白细胞介素 IL-17 和 IL-22,进而增强体内Th17 细胞介导的自身免疫45。研究表明,在获得性免疫的发展过程中,IL-17 和 IL-22 的上调可能刺激嗜中性粒细胞的募集,从而诱导炎症25。Li 等25发现 BUVSs 暴露后,il17a、il22基因和 IL-22 蛋白表达水平显著下调,可能通过干扰 AhR-IL17/IL22 通路对斑马鱼仔鱼产生免疫毒性。另有研究表明肠道通透性和促炎细胞因子之间存在正相关性46。机体在炎症状态下会产生大量的 IL-22,IL-22 通过刺激杯状细胞产生黏蛋白形成黏液层,发挥分离肠道内细菌并维持肠道上皮细胞完整性的作用,并能通过调控肠道菌群来降低结肠炎的发生概率47。本研究结果显示,UV-234 和 UV-P 暴露导致斑马鱼成鱼肠道IL-22 表达上调,而 UV-326 暴露后斑马鱼肾脏组织中 IL-17A 蛋白表达显著上调,这些结果表明 BUVSs在分子水平上引起免疫应激,可能诱导炎症反应。在本研究中,免疫相关蛋白在斑马鱼成鱼肠道组织和肾脏组织中的差异表达呈现组织特异性。肠道是鱼类免疫细胞相互作用和抗原呈递的主要场所,肠道相关淋巴组织分布在整个肠黏膜48。而肾脏是鱼体内代谢物排泄的主要器官,肾脏中的内皮细胞和巨噬细胞具有高度内吞作用,在清除代谢废物的过程中发挥重要作用49。研究报道,BUVSs 的生物富集在斑马鱼体内具有组织特异性,BUVSs 在肾脏中的生物浓缩系数 BCF(bioconcentration factor)高于肠道,更易于在肾脏中蓄积50。本研究中,斑马鱼成鱼经 BUVSs 暴露后,肠道中 CYP1A1 的活性未发生显著变化,而肾脏中 CYP1A1 的活性受到显著抑制,这可能是由于 BUVSs 在肾脏中的大量富集和代谢导致的。另外,鱼类血浆中的免疫球蛋白是其体液免疫系统的主要成分,由 B 淋巴细胞产生,专门用于维持内环境稳定51。未成熟的 B 细胞表面只有单体Ig-M,当 B 细胞识别并激活抗原时,发生类别