土壤病原微生物检测技术研究进展_徐菲.pdf
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1、农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022,41(12):2593-26032022年12月徐菲,杨凯,朱龙吉,等.土壤病原微生物检测技术研究进展J.农业环境科学学报,2022,41(12):2593-2603.XU F,YANG K,ZHU L J,et al.Advances in the detection technology of pathogenic microorganisms in soil J.Journal of Agro-Environment Science,2022,41(12):2593-2603.开放科学OSID土
2、壤病原微生物检测技术研究进展徐菲1,2,3,杨凯1,朱龙吉1,林文芳1,崔丽1*(1.中国科学院城市环境研究所,福建省流域生态重点实验室,福建 厦门 361021;2.中国科学院大学,北京 100049;3.福建农林大学资源与环境学院,福州 350002)Advances in the detection technology of pathogenic microorganisms in soilXU Fei1,2,3,YANG Kai1,ZHU Longji1,LIN Wenfang1,CUI Li1*(1.Fujian Key Laboratory of Watershed Ecolog
3、y,Institute of Urban Environment,Chinese Academy of Sciences,Xiamen 361021,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.College of Resources and Environment,Fujian Agriculture andForestry University,Fuzhou 350002,China)Abstract:Pathogenic microorganisms(e.g.,bacteria,viru
4、ses,and fungi)are ubiquitous in soil environments,threatening global publichealth.The development of a rapid detection technology for environmental pathogens is of great significance to reduce the spread ofpathogens,prevent and control infectious diseases,and maintain biosecurity.This article review
5、ed the recently developed and state-of-the-art techniques for detecting pathogenic microorganisms,including chromogenic cultivation,matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry,molecular biology tools,Raman spectroscopy,flow cytometry,and biosensors.A comprehensive ove
6、rviewand comparison of the principles,applications,advantages,and disadvantages of the presented techniques were shown.Finally,we putforward important perspectives for the future development of rapid detection methods,aiming to promote rapid diagnosis of soil pathogenicmicroorganisms and provide gui
7、dance for the control of biological risks.Keywords:biosafety and biosecurity;soil pathogenic microorganism;rapid detection technique;molecular biology tool;Ramanspectroscopy收稿日期:2022-10-11录用日期:2022-11-03作者简介:徐菲(1998),女,河北衡水人,硕士研究生,从事环境病原微生物快速检测研究。E-mail:杨凯与徐菲同等贡献*通信作者:崔丽E-mail:基金项目:国家自然科学基金项目(219226
8、08,22176186);中科院“从0到1原始创新”项目(ZDBS-LY-DQC027);福建省自然科学基金项目(2022J05095)Project supported:The National Natural Science Foundation of China(21922608,22176186);Chinese Academy of Sciences(ZDBS-LY-DQC027);TheNatural Science Foundation of Fujian Province,China(2022J05095)摘要:病原微生物如细菌、病毒、真菌等广泛存在于土壤环境中,其严重威胁着全
9、球公共卫生安全。发展病原微生物快速检测技术,对于减少病原菌扩散传播、防控传染性疾病、维护生物安全具有重要意义。本文对病原微生物检测技术的最新研究进展进行了综述,包括显色培养技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、分子生物学技术、拉曼光谱技术、流式细胞技术和生物传感器等,并对其原理、应用及优缺点进行了全面比较。最后,对病原微生物检测技术的未来发展提出展望,旨在促进土壤环境病原微生物的快速检测和生物风险防控。关键词:生物安全;土壤病原微生物;快速检测技术;分子生物学技术;拉曼光谱中图分类号:R124文献标志码:A文章编号:1672-2043(2022)12-2593-11doi:10.11654/
10、jaes.2022-1012农业环境科学学报第41卷第12期随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情的全球蔓延,由病原微生物引起的生物安全受到了全球的关注。病原微生物是长期引起人类传染性疾病的罪魁祸首,严重威胁着公共健康安全。为了有效防控病原微生物的威胁,生物安全被提到了国家安全战略的层面。2020年10月17日通过的 中华人民共和国生物安全法 为维护国家安全、防范和应对生物安全风险、保障人民生命健康,提供了法律准则。另外,我国国家卫生计生委早在2017年就组织制定了 国家致病菌识别网工作实施方案,明确提出要通过加强国家致病菌识别网建设,建立并不断完善适合我国国情的细菌性传染病监测模式,推
11、进细菌性传染病监测预警新技术和策略应用,从而提高疫情发现和防控能力。土壤中栖息着地球上最多样和最复杂的微生物群落1,是病原微生物赋存和大规模传播的主要媒介之一。并且土壤可耦合空气和水体等媒介,使得土壤病原微生物对植物、动物和人类的健康产生直接或间接的影响(图1)。土壤环境中的病原微生物种类多、来源广、风险异质性高、传播方式复杂多变,可通过环境介质在全球进行传播,造成全球性大流行病2-4。例如,土壤中广泛存在单核细胞增生李斯特菌、炭疽杆菌、大肠杆菌O157:H7、军团菌、诺卡氏菌等病原细菌5,并且其中许多病原微生物具有多重抗生素耐药性。除细菌外,土壤中还生存着300多种可感染人类和植物的真菌1。
12、对土壤病原微生物进行快速监测是控制其传播的关键。为提高病原微生物的检测能力,有必要发展快速甚至实时、灵敏、准确的检测技术,以便快速发现和定位环境介质中的病原微生物,采取适当措施,实施精准消杀,及时有效阻控病原微生物的传播6-7,保障生命健康安全。为此,本文综述了新近发展的多种环境病原微生物检测技术,根据其是否依赖培养划分为两大类,并进一步根据其检测信息(基因型或表型)和原理分成6类(图2),包括显色培养技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术、分子生物学技术、拉曼光谱技术、流式细胞技术和生物传感器。本文对这些病原微生物检测技术进行了详细总结和对比,并进一步对未来病原微生物检测技术的发展提出展
13、望,旨在为土壤环境病原微生物的快速检测和防控提供技术指导,保障生物安全。1基于培养的病原菌检测技术1.1 显色培养技术显色培养技术的原理是利用微生物生长繁殖过程中自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色,从而对目标微生物进行鉴定。该技术可直接对临床和环境中病原微生物或者混有多种微生物的样本进行检测,培养时长约为1824 h,现已成功用于水体8以及临床9中病原微生物的检测。目前常用的主要有大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌等显色培养基,该技术可对病原微生物进行粗筛和分离,其灵敏度和特异性优于传统培养基,但由于环境复杂、干扰较大,显色培养技术存在一定程度的误判,其准确性需要借
14、助其他技术进行进一步确认。1.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术除显色培养基以外,基于培养的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)也被广泛用于病原微生物的快速检测。MALDI-TOF MS是近年来兴起的基于不同细菌特征蛋白指纹图谱的检测技术,通过对微生物菌落进行检测,并与数据库中已知病原菌信息比对来实现病原微生物的快速诊断。该技术具有高通量、快速、准确、流程简单等特点,已成功应用于植物10、临床11病原微生物及其耐药性的相关研究中。这两种依赖培养的方法虽已实现对病原微生物的检测,但是局限性在于无法对 VBNC(Viable ButNonculturable)状态的病
15、原菌或者环境中未培养的微生物开展研究12,并且需要对病原微生物进行培养,比较费时。为了更好地实现环境中病原微生物的快速和准确鉴别,近年来发展出一些不依赖于培养的技术,这些图1 土壤、空气、水体、植物、动物和人类病原微生物之间的联系Figure 1 Link between soil,air,water,plant,animal and humanpathogenic microorganisms2594徐菲,等:土壤病原微生物检测技术研究进展2022年12月技术使得环境中病原微生物的快检得以迅速发展,并已投入到实际环境应用中,显示出巨大的发展潜力。2分子生物学技术分子生物学技术用于快速检测病原
16、微生物,主要是基于病原微生物的特异DNA或RNA标记基因序列进行分析,主要包含聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)技术、高通量测序技术等。2.1 PCR技术PCR技术是在体外模拟DNA合成过程,通过三步反应循环(变性、退火和延伸)扩增特定的靶DNA序列,实现靶序列的指数扩增(图3A)。实时荧光定量PCR(qPCR)技术是在PCR技术基础上,引入荧光染料或者探针,在扩增过程中实时监测目的基因的荧光信号强度,通过内参法或者外参法对样品中特定的基因进行定量分析(图3A)。qPCR技术相较于传统培养方法,大幅降低了病原微生物的检测限,且分析快速,目前已广泛用于快速
17、检测和定量土壤、水体和空气等环境中的细菌、真菌等病原微生物。例如,NGUYEN等15利用手持式便携qPCR系统对过滤水样中嗜冷黄杆菌实现了50 min内的快速现场监测。YAO等16利用qPCR和Illumina测序技术对施用生物炭后土壤细菌和真菌群落的变化进行了长期监测。考虑到 PCR技术检测通量低的局限性,研究者发展出了多重PCR技术。多重PCR技术是在PCR反应管中同时加入多种特异性引物进行PCR扩增,该技术具有高通量、低成本等优点。近年来,多重PCR技术为水环境中病原微生物的联合检测提供了一种快速、灵敏的方法,已成功应用于检测地表水中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌属、沙门氏菌等病原微
18、生物,检测限为31023103CFUmL-1 17。朱永官团队还开发出病原菌检测的高通量定量PCR技术平台18-19(图3B)。该技术可以同时对23种人类病原菌的68个标记基因和10种粪源宿主的23个标记基因进行定量检测。利用该技术,AN等14对厦门13个海滨浴场的水体进行病原菌检测和污染溯源,为病原菌相关的健康评估提供了数据支持。微滴式数字 PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)是第三代 PCR 技术(图 3A),可用于绝对定量,且比qPCR 具有更高的聚合酶链式反应抑制剂的耐受能力,在处理复杂环境样品(如水样沉积物)时具有优势。SINGH等20使用ddPCR和qPCR
19、分别对河流沉积物中的沙门氏菌进行检测,发现ddPCR显著提高了图2 土壤等环境病原微生物检测技术汇总Figure 2 Summary of detection techniques for pathogenic microorganisms in soil and other environments2595农业环境科学学报第41卷第12期分析灵敏度和低浓度沙门氏菌的检测,结果证明ddPCR更适用于沙门氏菌的检测,该技术稳定、准确、高通量,并且检测河流沉积物类的环境样品比qPCR更加灵敏。上述 PCR相关技术的主要缺点是设备昂贵,需要繁琐的热循环、额外的设备以及较高的专业技能。为了加快环境病原
20、微生物的快速检测,环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)投入应用,该技术是近年来新开发的一种恒温基因扩增技术21,主要包括模板合成、循环扩增以及延长和再循环阶段,具有简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强等优点,缺点是扩增效率比较低、常因为非特异性而导致假阳性结果、引物设计复杂、反应体系容易被污染、扩增产物难定量等22。LAMP可以在资源匮乏地区且无专业技术人员情况下,进行环境中微生物的快速检测23,该技术已经被应用于检测空气中的金黄色葡萄球菌24以及水体中的大肠杆菌25、沙门氏菌25等病原菌。2.2 高通量测序高通量测序主要利用
21、特异性标记基因、毒力因子和16S rRNA基因鉴定致病菌,利用此技术可以获得环境中多种微生物物种、结构、功能以及遗传多样性等方面的丰富信息。该技术具有通量大、可直接测定病原微生物的核酸序列、检测限低等优势,但是检测成本高,难以完全取代常规病原微生物检测方法,且数据分析耗时。目前第二代测序技术是主导的测序技术,主要的测序平台为454测序平台和Illumina测序平台7。CAO 等26利用 Illumina HiSeq2000 对雾霾空气微生物宏基因组进行了测序研究,在种的分类水平上对环境空气中细菌、真菌、古菌和dsDNA病毒等微生物进行了检测鉴定27。YANG等28利用Illumina对水体环境
22、和塑料际微生物的16S rRNA进行测序,并将测序结果与病原菌数据库进行比对,共检测到水体及塑料际包括分枝杆菌、李斯特菌、芽孢杆菌、假单胞菌、肠杆菌等在内的多种人体潜在致病菌。3拉曼光谱技术拉曼光谱正发展成为一种不依赖于培养的微生物快速检测和识别的新兴检测手段。与分子生物学技术相比,拉曼光谱可以直接、快速、无损地对低至单个微生物进行检测,且可借助稳定同位素标记区分死、活细胞,为病原微生物的快速检测提供了新的手段。3.1 拉曼光谱原理1928年,印度物理学家拉曼首次发现拉曼散射现象。拉曼光谱是一种基于分子振动的光谱技术。入射光与分子化学键作用后,发生非弹性拉曼散射,通过检测与入射光频率不同的拉曼
23、散射光,获得物质的化学组成和分子结构等信息。3.2 单细胞拉曼光谱单细胞拉曼光谱研究微生物的主要优点包括28-29:单细胞水平检测。与光学显微镜结合可提供低至1 m的空间分辨率,实现对单个细菌的直接图3 PCR相关技术原理及流程图Figure 3 Principles and flowchart of PCR-related technology(A)PCR、qPCR以及 ddPCR 原理图13(B)高通量定量PCR技术流程142596徐菲,等:土壤病原微生物检测技术研究进展2022年12月检测,克服冗长的培养限制,实现快速检测;丰富的化学信息。拉曼光谱提供微生物所含多种生物分子的指纹图谱,包
24、括核酸、蛋白质、脂质、色素(如类胡萝卜素、细胞色素c等),这些拉曼特征会随种属或生理状态的变化而灵敏改变。与统计分析或机器学习结合时,拉曼光谱可在不同分类水平,如属、种甚至菌株水平区分病原菌;无损检测。允许下游特定功能单细胞的基因组分析,提供了一种关联拉曼表型和基因型的方法,对于全面深入认识环境中致病菌和抗生素耐药性非常重要29。近年来,基于不同微生物的特征指纹图谱,拉曼光谱已被用于快速识别土壤、水体、临床中的病原微生物,甚至在低至单个菌株水平上有很高的准确度。例如,WALTER等30采用拉曼光谱结合线性判别分析(Linear Discriminant Analysis,LDA),研究了作为土
25、壤重金属污染的生物指示剂链霉菌属细菌,识别了不同Ni2+浓度培养基中链霉菌的单细胞拉曼光谱,预测精度为88%。此外,有研究者还利用拉曼光谱结合支持向量机鉴定瓶装矿泉水独立样本中的铜绿假单胞菌,准确率达到85%31。SCHUSTER等32-33首先在单细胞水平引入拉曼光谱进行微生物研究,证明拉曼光谱可以作为一种快速、可靠的技术方法用于人类致病菌军团菌的识别分类。此后,MONTANARI等34将单细胞拉曼技术与经典微生物检测技术相结合,成功鉴别出288 份血液透析用水中分离的146种临床酵母菌种,证实了单细胞拉曼光谱对血液透析用水中真菌鉴别的可行性。由于微生物光谱数据集差异较小,尤其是低信噪比的光
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