条斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表达对不同碳源的响应_刘雪莹.pdf
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1、 138 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 条斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表达对不同碳源的响应 刘雪莹1,2,3,4,王广策2,3,4,张宝玉2,3,4,宫相忠1(1.中国海洋大学 海洋生命学院,山东 青岛 266003;2.中国科学院海洋研究所 实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266071;3.青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生物学与生物技术功能实验室,山东 青岛 266237;4.中国科学院海洋大科学研究中心,山东 青岛 266071)摘要:丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)在非光合生物中催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸(oxaloaceta
2、te,OAA),作为糖异生的第一步,在动物维持代谢稳态中具有重要作用。研究发现,PYC 在光合生物中也发挥重要作用。为了探究 PYC 在潮间带大型海藻中的作用,我们从条斑紫菜叶状体中扩增获得 PYC 基因全长序列(命名为 PyPYC),并分析了其序列特征。通过对系统进化树分析表明 PyPYC与来自细菌的 PYC 具有较近亲缘关系。针对条斑紫菜叶状体生长环境所面临的碳源变化,设置了不同类型和不同浓度的无机碳培养条件,采用实时荧光定量(RT-qPCR)检测了该基因对这些无机碳源的响应。结果表明,高浓度的 CO2能显著上调 PyPYC 基因的表达,而高浓度的 HCO3对其影响较小。由此,我们初步认为
3、,当紫菜叶状体暴露在空气中时,PYC 在其无机碳利用中发挥一定作用。关键词:丙酮酸羧化酶;条斑紫菜;无机碳利用 中图分类号:Q71 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2022)12-0138-10 DOI:10.11759/hykx20220422001 条斑紫菜(Pyropia yezoensis)是属于原红藻纲(Protoflorideae)、红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜属(Pyropia)的一种大型海藻,是东南亚地区重要的经济海藻之一。它的生活史是由丝状孢子体和叶状配子体组成,属于异型世代交替1-2。紫菜营养丰富,富含氨基酸、蛋白质、
4、不饱和脂肪酸及多种微量元素,是低脂肪高蛋白的健康绿色食品;因其含有丰富的多糖尤其是琼胶,也使其成为重要的化工原料;紫菜除了经济价值和营养价值外,其叶状体在生长过程中可大量吸收 C、N、P 等,是海洋生态系统中重要的碳库、氮库和磷库3。紫菜作为潮间带海藻,野生型叶状体随潮汐变化会经历暴露在空气中数小时和没入水中的生境变化,在规模化养殖过程中,渔民也需要定期将紫菜苗帘暴露在空气中以去除杂藻及提高品质4。为更深入了解紫菜,国内外学者对紫菜的生活史、影响生长因素、抗逆和代谢产物等方面开展了大量的研究,使之逐渐成为研究红藻的代表性物种5-7。丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PYC
5、)最早在鸡的肝脏线粒体中发现8,后来在非光合生物真菌线粒体中也发现了 PYC。它属于生物素酶家族,其特征是具有共价连接的生物素作为辅助因子,依赖 ATP,催化丙酮酸和 HCO3生成草酰乙酸(oxaloacetate,OAA),该反应作为糖异生的第一步,在动物维持代谢稳态中具有重要作用9。如哺乳动物中 PYC 的缺失会引发神经系统紊乱,代谢性酸中毒或癌症等多种代谢疾病10-11。缺乏 PYC 基因的酿酒酵母(Saccharo-myces cerevisiae)突变体在葡萄糖作为唯一碳源时,不能存活12-13。1990 年,研究者在胡萝卜、玉米、向日葵和油菜的细胞提取液发现了 PYC 活性,首次证
6、明了植物中 PYC 的存在,但尚未明确其在植物不同部位或发育过程中的功能14。随着研究技术的发展和水平 收稿日期:2022-04-22;修回日期:2022-07-14 基金项目:国家自然科学基金(41876163);中国科学院海洋大科学研究中心重点部署项目(COMS2019Q02);山东省“泰山学者”工程专项经费资助项目(tspd20210316);财政部和农业农村部:国家现代化农业产业技术体系(CARS-50)Foundation:National Natural Science Foundation of China,No.41876163;The Key Deployment Proje
7、ct of the Centre for Ocean Mega-Research of Science,the Chinese Academy of Sciences,No.COMS2019Q02;Taishan Scholar Project of Shandong Province,No.tspd20210316;Ministry of Fi-nance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs:National Modern Agri-cultural Industry Technology System Project,No.CARS-
8、50 作者简介:刘雪莹(1998),女,山东泰安人,硕士研究生,主要从事藻类分子生物学与发育调控研究,E-mail:;张宝玉(1975),通信作者,副研究员,主要从事藻类分子生物学和发育调控,E-mail:;宫相忠(1963),通信作者,教授,主要从事海藻繁殖生物学研究,E-mail: Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 139 的提高,PYC 陆续被发现存在微藻中15-16。Tsuji 等17证实丙酮酸羧化酶存在海洋单细胞藻 Emiliania hux-leyi 质体中,Km(米氏常数:酶促反应达到最大反应速度一半时对应的底物浓度)值显示该质体丙酮酸羧化酶对丙
9、酮酸有较高的亲和性,主动参与羧化用于回补OAA,作者推测 PYC 或许在各种水生光合生物中起着不可或缺的作用。当绿藻 Coccomyxa subellipsoidea C-169 培养在 2%CO2环境时,PYC 的 RNA 水平和酶活均增加,作者认为 PYC 参与 CO2固定进而提高 C.subellipsoidea 无机碳利用率16。综上所述,PYC 似乎在促进水生光合生物无机碳利用方面发挥一定的作用,到目前为止我们对此还是了解较少。我们前期在分析条斑紫菜叶状体和丝状体对不同无机碳响应的转录组数据(该转录组数据见国家基因库 https:/gb.org/cnsa/,序列入口为 CNP0000
10、880)时,发现有类似于 PYC 的 unigene 序列,TRINITY_DN105351_ c0_g1和TRINITY_DN15039_c0_g1,但对该基因及相应蛋白的特点,以及在紫菜中发挥的功能知之甚少,因此本文对条斑紫菜丙酮酸羧化酶展开详细研究。以条斑紫菜叶状体 cDNA 为模板扩增获得PyPYC 基因全长编码区序列后,与来自其他物种的丙酮酸羧化酶核酸及蛋白序列进行比对分析,明确PyPYC 序列特征。同时用加富 CO2的空气或改变人工海水中 NaHCO3浓度方式设置不同无机碳源条件培养紫菜叶状体,探究 PYC 基因在条斑紫菜叶状体无机碳利用中的响应。1 材料与方法材料与方法 1.1
11、材料材料 条斑紫菜叶状体来自中国科学院海洋研究所藻类种质库,在含有 PES 营养盐的无菌海水中培养。培养条件为:温度 1518,光照强度 1530 molm2s1,光暗周期为 14 h10 h,每周更换 1 次培养基。1.2 方法方法 1.2.1 条斑紫菜不同碳源处理条斑紫菜不同碳源处理 选取叶片大小相近且生长旺盛的健康藻体为材料,分别置于含不同浓度 NaHCO3人工海水培养,NaHCO3终浓度分别为 2、4、8 mmol/L。NaHCO3浓度设置基于在 15,pH 8.07时,自然海水中可溶性无机碳浓度为 2.1 mmol/L,而可溶性无机碳的主要成分是 HCO3,占 91%18。每 150
12、 mL 人工海水培养 0.03 g 新鲜藻体,其余培养条件同上。参考文献19-20室内培养紫菜方法,每 2 d 全部更换培养基的培养条件,我们将培养在不同 NaHCO3浓度的叶状体培养 24 h 后,光照时采收。在以 CO2为碳源的处理中,我们将条斑紫菜叶状体平铺于细胞培养瓶中的滤纸上并一直保持湿润,分别往培养瓶中通入正常空气(CO2体积分数为4.17104)和加富CO2的空气(CO2终体积分数分别为1103和 2103)。青岛附近海域的半日潮使得野外生长的条斑紫菜干出时间约为 24 h,因此我们将条斑紫菜叶状体处理 3 h 后采收,吸干表面水分后用液氮冻存,以备后续使用。在处理过程中始终保持
13、不低于 60%的含水量,光照强度 30 molm2s1,温度1518。以上实验设计每组处理设置 3 个平行。1.2.2 RNA 提取及反转录制备提取及反转录制备 cDNA 条斑紫菜叶状体 RNA提取及反转录方法参考文献21。简介如下:约 100 mg 新鲜培养的叶状体用吸水纸吸掉表面的水分,迅速用液氮冷冻研磨,然后用植物 RNA 提取试剂盒(天根,北京)提取。提取的 RNA 首先用 1%的琼脂糖凝胶电泳检验其质量,然后用 Nanodrop Photometer 分光光度计(德国)测定RNA 的纯度与浓度。用于扩增目的基因的 cDNA 采用 MMLV 试剂盒(promega)反转,反转过程未去除
14、基因组 DNA。用于实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)的 cDNA 依据 Takara反转录酶试剂盒说明书(TaKaRa,大连)进行,具体实验操作步骤如下:1)去除基因组 DNA 反应。5gDNA Eraser Buffer 2 L,gDNA Eraser 1L,Total RNA(1 000 ng),添加 RNase Free dH2O 至 10 L;42 2 min;2)反转录反应。向步骤 1 的反应液中加入以下试剂,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 L,RT Primer Mix 1 L,5Primescript Buffer 4 L,RNase Free
15、dH2O 4 L;37 30 min,85 5 s,4 保存。所获 cDNA 模板置于20 暂存。1.2.3 目的基因扩增目的基因扩增 分析转录组 unigene TRINITY_DN105351_c0_g和 TRINITY_DN15039_c0_g1 序列后,利用 Primer Premier 5.0 设计用于扩增目的基因的引物,引物名称及序列见表 1。采用 Touchdown 程序,即:94 2 min,98 30 s,接下来 10 循环 98 30 s,65 15 s,68 150 s,每个循环退火温度降低 0.1,接下来进入 30 个循环为 98 30 s,55 15 s,68 150
16、 s,DNA 聚合酶为 Tks Gflex(TaKaRa,大连),所用仪器为 SensoQuest Labcycler(SensoQuest,德国)。140 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 表表 1 本文所用引物序列 Tab.1 Primers used for PCR and RT-qPCR 引物名称 序列(53)PyPYC1-F ATGTATTTACGCGCAAAGTCAGTAAACT PyPYC1-R TTATTCCAGTTCTACTATCAAGTCTCCAGCT PyPYC2-F ATGTTTGGCACCAAGACGTCG PyPYC2-R TCACGCCCCAGC
17、CGC qPYC-F CTACCGCAACGCTGGCACTG qPYC-R CTCTTCGCTCACCGTGTGTTCC GAPDH-F CCAACAAGTGGGAGTAAGCG GAPDH-R GGACAGAACCGAACAGCGTA 1.2.4 序列分析及系统进化树构建序列分析及系统进化树构建 所获得的序列在 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上用 BLASTx 进行比对。跨膜结构预测采用TMpred 软件22,信号肽预测采用 SignalP 5.0 版(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。多序列比对采
18、用 Clustal程序23。采用 MEGA 10.0 软件24和最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统进化树,重复次数为1 000次,建树所用的最佳模型为WAG+G+I模式。1.2.5 实时荧光定量实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)用于 RT-qPCR 的引物名称及序列见表,并在图1B 中用双下划线标出。以 GAPDH 为内参基因25。反应所用试剂购自Roche公司(Switzerland),仪器为Quant Studio1(Thermo Fisher Scientific Inc.,U.S.)。PCR 反应条件为:94 2 min,接下来40循环为94 15 s
19、,60 15 s,72 20 s,扩增结束后的溶解曲线分析为检测扩增产物特异性。RT-qPCR 数据采用相对定量法分析,用SPSS 单因素方差分析检验显著性差异水平。2 结果与分析结果与分析 2.1 PyPYC 基因核酸全长序列的获得基因核酸全长序列的获得 引 物 对 PyPYC1-F/PyPYC1-R 和 PyPYC2-F/PyPYC2-R 分别对应 TRINITY_DN15039_c0_g1 和TRINITY_DN105351_c0_g1 序列。尽管在模板浓度、退火温度以及 Taq 酶等方面都做了很多尝试,用PyPYC1-F/PyPYC1-R 引物无法获得 PCR 产物,也就是说不能获得
20、RINITY_DN15039_c0_g1 对应序列。而且,该 unigene 序列在条斑紫菜基因组序列7(BioProject PRJNA589917 in NCBI)中也无匹配序列。因此,我们初步认为来自转录组的 TRINITY_ DN15039_c0_g1 为 来自细 菌 污 染。采 用 引 物对PyPYC2-F 和 PyPYC2-R 获得大约 4 K 的 PCR 产物(图 1a)。测序后共获得 3 546 bp 的核酸序列,除去324 bp 的内含子 区外,其余部分与 TRINITY_ DN105351_c0_g1 相同(图 1b)。该序列对应条斑紫菜基因组第一条染色体上从 14 819
21、 602 至 14 823 147区域的核酸序列。经 BlastX 比对发现,该序列与来自红藻 Porphyridium purpureum PYC1 氨基酸序列(序列入口号:KAA8491876.1)有 61%的相似性,与细菌 Sandaracinaceae bacterium 的 PYC 氨基酸序列(RZO64306.1)有 53%的相似性,从而确定该产物为条斑紫菜的 PYC 基因,命名为 PyPYC。2.2 序列特征分析及系统进化树分析序列特征分析及系统进化树分析 丙酮酸羧化酶催化丙酮酸和 HCO3结合生成草酰乙酸的整个反应分为以下两步进行26-28:2Acetyl-CoA Mg32En
22、z-biotinATPHCOADPPiEnz-biotin-CO+-+(1)2Enz-biotin-COpyruvateEnz-biotinoxaloacetate-+(2)在结构上,典型的丙酮酸羧化酶由 4 个相同的亚基排列成四面体状结构,每个亚基包含 3 个功能结构域:生物素羧化(BC,biotin carboxylase)结构域、转羧基(CT,carboxyltransferase)结构域以及生物素羧基载体(BCCP,biotin carboxyl carrier protein)结构域27,29。这种依赖生物素的羧化酶在 2 个活性位点以 2 个连续的步骤执行它们的活性,在第一步反应中
23、,可移动的羧基载体生物素在 BC活性部位进行羧化,这一过程需要 Mg-ATP 提供能量。然后,结合了羧基的生物素被 BCCP转移到 CT活性中心将羧基转移到底物丙酮酸上,使丙酮酸完成羧化反应30。并且,PYC 的每个亚基都含有一个紧密结合的二价金属离子(Zn2+/Mg2+),它作为 PYC的辅助因子似乎起着结构性的作用27。Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 141 图 1 采用 PyPYC2-F 和 PyPYC2-R 引物扩增 PyPYC 基因及其核苷酸序列和对应的氨基酸序列 Fig.1 Electrophoresis pattern of the DNA f
24、ragments amplified with the PyPYC2-F and PyPYC2-R primer pairs,nucleotide sequence of PyPYC and its relative putative amino acids 注:图 1b 中黑色加粗处为内含子区域,单下划线为扩增基因全长序列所用引物区,双下划线为荧光定量检测所用引物区。142 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 我们采用 ClustalX 软件将不同来源的 PYC 氨基酸序列进行比对和相似性分析(表 2 和图 2),发现来自不同物种的 PYC 氨基酸序列具有较高的保守性,PyP
25、YC 与来自 Coccomyxa subellipsoidea C-169、Saccharomyces cerevisiae 和Rhizobium phaseoli Ch24-10 的 PYC 分别有 41.2%,42.6%和38.3%相似性(表 2)。在这些物种 PYC 序列上已经证实的活性位点区域,如与 Mg-ATP 结合的位点(ERNCSIQRRHQKV 和 QVEH),BCCP 结构域中的生物素结合位点(AMKM),CT 结构域中丙酮酸结合位点(ETWGGATFDVAM RFLECPWERL)和 1 个二价金属离子(Zn2+/Mg2+)结合位点(HVHTH)等31,在 PyPYC 序列
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