散装即食食品中3种食源性致...光定量PCR检测方法的建立_崔洁.pdf
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1、 312 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期收稿日期:2022-11-17 *通信作者 基金项目:浙江省药品监管科技计划项目(2023010);2021年度舟山市科技计划项目(2021C31003);浙江省市场监督管理局青年科技项目(QN2023455)。作者简介:崔洁(1989),女,浙江嘉兴人,硕士研究生,研究方向为食品微生物检测。崔 洁1,2,黄朱梁2,严卓彦2,孙 瑛2,林吉恒2,夏瑛瑛2,王萍亚2*,邓尚贵1(1.浙江海洋大学食品与药学学院,浙江 舟山 316000;2.舟山市食品药品检验检测研究院,浙江
2、舟山 316000)摘要:该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法,根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cerA基因分别设计3对特异性引物与探针,并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选,建立多重荧光定量PCR检测方法,同时评估其特异性、灵敏性及重复性,并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌,同时与国标法比对。结果表明,建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌,其他菌株均不扩增,灵敏度
3、分别为4102、3102、2102 cfu/mL,且批内和批间变异系数均小于2%,重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对,多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法,且检测时间大幅缩短。综上所述,建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确,在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。关键词:散装即食食品;多重荧光定量PCR;沙门氏菌;金黄色葡萄球菌;蜡样芽孢杆菌中图分类号:TS 207.4 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2023)04-0312-08Establishment of A Multip
4、lex Fluorescence Quantitative PCRAssay for the Detection of Three Foodborne Pathogens in BulkReady-To-Eat FoodCUI Jie1,2,HUANG Zhuliang2,YAN Zhuoyan2,SUN Ying2,LIN Jiheng2,XIA Yingying2,WANG Pingya2*,DENG Shanggui1(1.College of Food and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316000,China;2.Zhou
5、shan Institute of Food&Drug Control,Zhoushan 316000,China)Abstract:The aim of this study was to establish a multiplex fluorescence quantitative PCR method for the detection of three food-borne pathogens,Salmonella,Staphylococcus aureus and Bacillus cereus,in bulk 散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立DOI:1
6、0.13684/ki.spkj.2023.04.038 313 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0 引言食源性疾病不仅是当今世界引起广泛关注的公共卫生问题之一,也是食品安全的首要重点。全世界每年因食用各种病原菌污染的食品和饮用水导致的食源性疾病的案例多不胜数。有数据显示1,我国平均每年发生的一万多例食物中毒事件中,由各种病原菌引起的食物中毒比例占三成以上。20032015年全国共报告1050起学校食源性疾病暴发事件2-4,累计发病37281人次,由沙门氏菌(16.01%)、金黄色葡萄球菌(20.93%)、蜡样芽孢杆
7、菌(29.24%)所致的发病人数占比最大。沙门氏菌感染后轻则呕吐腹泻,重则引起急性肠胃炎、败血症等疾病,严重危害人体健康,在禽畜肉中较易检出5-6。极易污染肉、蛋、乳制品的金黄色葡萄球菌也是引发食源性疾病的罪魁祸首之一,其产生的肠毒素不易被高温破坏,通过食物入侵人体后易引起急性胃肠炎7-8。米饭及其制品中最易出现的蜡样芽孢杆菌也不可小觑,一般在夏秋季高发,其所分泌的毒素污染食物被人误食后,轻则呕吐腹泻,重则可导致死亡,例如寿司、饭团、炒饭等米饭制品为此类感染重灾区9-11。随着外卖、社区团购的兴起,人们的膳食习惯也在悄然改变。超市、菜场里随处可见的盒装预制菜、酱卤肉制品等散装即食食品都已经过烹
8、煮、烫热,无需再对其进行额外加工处理即可食用,既省去了繁琐的包装,售卖随意,食用也更加便捷,备受生产者与消费者的推崇12。但是与预包装食品不同的是,这类散装即食食品并没有经过严格的出厂检验,卫生安全条件难以保证,在制作和销售过程中,加工人员与食品的接触、器具的混用等因素很容易导致微生物的二次污染,增加了食源性疾病的潜在风险13。为了强化生产经营全过程规范管理、加强对散装即食食品的市场监管,由国家卫健委和市场监管总局联合发布的GB 316072021食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量于2022年3月7日正式实施14。该标准作为我国首部针对散装即食食品设置致病菌限量的食品安全国家标准,意义
9、非凡。标准中对散装即食食品的3个大类分别需要检测的致病菌以及各致病菌的限量都提出了明确要求,比如热处理散装即食食品和部分或未经热处理散装即食食品都要求检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌这3种主要致病菌。但是传统的细菌分离鉴定需要前增菌、选择性培养和生化实验3个步骤,通常需要46 d,不仅操作繁琐、费时费力,对食物中毒的信息诊断滞后,而且在平板菌落的挑取过程中,容易出现肉眼判断误差,造成错判漏检,难以满足食源性疾病时效性与准确性的要求,特别是在大批量的食品样本的检测过程中,这种缺点体现ready-to-eat food.Three pairs of specific primers an
10、d probes were designed according to the invA gene of the infected epithelial cell surface protein of Salmonella,the nuc gene of Staphylococcus aureus,and the cerA gene of Bacillus cereus.The addition amount of primers and probes in the system and the annealing temperature were optimized and screened
11、.To establish a multiplex fluorescence quantitative PCR assay,and evaluate its specificity,sensitivity and repeatability,and apply this assay to detect pathogenic bacteria in bulk ready-to-eat food samples and compare it with the national standard method.The results showed that the established multi
12、plex fluorescence quantitative PCR assay could specifically amplify only Salmonella,Staphylococcus aureus and Bacillus cereus,with the sensitivity of 4102 cfu/mL,3102 cfu/mL and 2102 cfu/mL respectively.The intra-run and inter-run coefficients of variation were less than 2%,and the repeatability and
13、 stability were good.At the same time,100 bulk ready-to-eat food samples were detected and compared by national standard method and multiple fluorescence quantitative PCR method.The positive detection rate of multiple fluorescence quantitative PCR method was slightly higher than that of traditional
14、national standard method,and the detection time was greatly shortened.In conclusion,the established multiplex fluorescence quantitative PCR method has strong specificity,high sensitivity,rapid and accurate,and has a good application prospect in the rapid screening of foodborne pathogens.Key words:bu
15、lk ready-to-eat food;multiple real-time PCR;Salmonella;Staphylococcus aureus;Bacillus cereus 314 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期地更加明显15-16。近年来,以常规PCR为基础的各种新型PCR技术不断出现,及时弥补了这一缺陷。特别是实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time,PCR)技术,为食品中致病菌的高通量快速检测开辟了新路径。其代表方法TaqMan探针法,只需在体系中添加合成好的引物与探针,
16、当聚合酶延伸将前方探针水解,5端的发光基团与3端的猝灭基团分开而产生荧光信号,借助荧光信号的不断累积可对整个PCR反应进行实时监测,最终可根据Ct值和标准曲线对未知模板浓度进行定量分析17。引物与探针的双重保证不仅特异性更强,而且在对批量样本进行检测时,只需前增菌并提取核酸,便可在2 h内得知实验结果,因其灵敏、快速、特异、高通量等优势,使之成为食源性致病菌快速检测技术的重要研究方向18。因此,本研究拟通过TaqMan探针法,建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光定量PCR方法,为散装即食食品中病原微生物的食品安全风险监测工作提供技术支持。1 材料与方法1.1
17、材料1.1.1 实验菌株 实验所用标准菌株:目标菌株3株,为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌;非目标菌株7株。均购自标准菌株保藏中心,保藏于舟山市食品药品检验检测研究院内,详见表1。表1 实验菌株信息编号名称来源CMCC50041肠炎沙门氏菌中国药品生物制品检定所ATCC26112金黄色葡萄球菌中国药品生物制品检定所ATCC11778蜡样芽孢杆菌美国菌种保藏中心ATCC17802副溶血性弧菌中国药品生物制品检定所ATCC25922大肠埃希氏菌中国药品生物制品检定所ATCC9027铜绿假单胞菌中国药品生物制品检定所CMCC51592宋内氏志贺氏菌中国药品生物制品检定所ATCC51329阪崎
18、肠杆菌中国药品生物制品检定所CMCC54002单核细胞增生李斯特氏菌中国药品生物制品检定所ATCC21059 乙型溶血性链球菌美国菌种保藏中心1.1.2 材料与试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、亚希酸盐胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)基础、亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、Baird-Parker培养基基础、BHI肉汤、营养琼脂(NA)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤基础、甘露醇卵黄多黏菌素琼脂基础等培养基:北京陆桥技术股份有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒:生工生物工程(上海)股份有限公司;引物探针:宝生物工程(大连)有限公司合成。
19、1.1.3 主要仪器 ABI7500实时荧光定量PCR仪:美国AB公司;NanoDrop one核酸蛋白分析仪和高速台式离心机:美国Thermo Fisher Scientific公司。1.2 方法1.2.1 设计引物与探针 本实验以沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cerA基因为特异基因设计3对引物与探针,均委托宝生物工程(大连)有限公司合成,引物与探针信息详见表2。表2 引物与探针菌株靶基因序列(5-3)沙门氏菌invAF:5-AACGTGTTTCCGTGCGTAAT-3R:5-TCCATCAAATTAGCGGAGGC-3
20、P:VIC-5-TGGAAGCGCTCGCATTGTGG-3-TAMRA金黄色葡萄球菌nucF:5-AGTATATAGTGCAACTTCAACTAAA-3R:5-ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAATA-3P:FAM-5-AGTTGACAAAGCTCAAAGAACTGATAAAT-3-BHQ1蜡样芽孢杆菌cerAF:5-GCTAAAAGGTGTACTTAGCTTAGG-3R:5-ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAATA-3P:CY5-5-AGTTCCGCTATATAAAGCTCCTAAACCAA-3-BHQ21.2.2 标准菌株鉴定 按照GB 4789食品安全国家标准 食品
21、微生物检验方法对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌标准菌株进行分离鉴定。1.2.3 模板DNA的提取 分别将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌接种于营养肉汤、BHI肉汤和胰酪胨大豆多黏菌素肉汤中复苏,36 315 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期培养过夜后,分别取原液1 mL进行10倍递增稀释至108浓度,并倾注营养琼脂进行平板计数,同时每个稀释度各吸取1 mL至离心管进行模板DNA的提取。分别采用热煮沸法和细菌基因组DNA提取试剂盒法提取DNA,并对提取结果进行比较,最终选用提取效果更好的细菌基因组DNA
22、提取试剂盒法,并将DNA模板冻存于20 冰箱备用。1.2.4 单重实时荧光PCR的扩增 分别以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌梯度稀释的核酸为模板进行单重荧光PCR扩增,其中大肠埃希氏菌为阴性对照,无菌超纯水为空白对照。反应体系为25 L:2Probe qPCR Mix 12.5 L,上下游引物与探针(10 mol/L)各1 L,Rox reference Dye 0.25 L,DNA模板5 L,dH2O补足至25 L。反应条件为:95 预变性3 min;94 变性5 s,60 退火延伸30 s,40个循环。1.2.5 单重实时荧光PCR标准曲线的建立及灵敏度实验 将过夜培养好的沙门氏菌
23、、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的纯菌液分别10倍梯度稀释至108浓度,取104、105、106、107、1085个浓度的菌液1 mL,分别倾注胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和营养琼脂(NA)平板,每组各2个平行,比较TSA与NA上的菌落生长状况,并选取平行较好的平板进行计数。同时各取1 mL稀释液按1.2.3中方法提取核酸后进行单重实时荧光PCR扩增,以菌液浓度为横坐标,Ct值为纵坐标绘制标准曲线,观察其检出限,以测试其灵敏度。1.2.6 多重实时荧光PCR体系的优化和建立 基于单重实时荧光PCR反应体系,先将3组目标菌株的引物与探针两两结合进行扩增,确定彼此之间不会互相干扰,再对3组多重体系中的
24、引物探针的添加量以及退火温度等进行筛选和优化,确认最优反应条件。在确保方法特异和稳定的基础上,以期获得较低Ct值和较高的荧光增量Rn为目标,对各参数进行最佳配比,建立多重实时荧光PCR检测方法。1.2.7 多重实时荧光PCR的特异性实验 提取3株目标菌株和7株非目标菌株的DNA,并以此为模板,利用建立的多重荧光定量PCR反应体系,以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3株菌株为阳性对照,其他7株非目标菌株为阴性对照,dH2O为空白对照进行三重实时荧光PCR扩增实验,观察目标菌的特异性扩增以检测本方法的特异性,Ct值显示“Undet”或无明显S型扩增曲线均为阴性。1.2.8 多重实时荧光PCR
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