咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的毒性作用和SOD活性的影响_方舒.pdf
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1、农 药AGROCHEMICALS方舒,蔡梦醒,陈梦雅,等.咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的毒性作用和SOD活性的影响J.农药,2023,62(3):184-189.doi:10.16820/j.nyzz.2023.2020收稿日期:2022-09-25,修返日期:2022-11-10基金项目:安徽省高等学校省级自然科学研究计划项目(KJ2017A448);巢湖学院食品科学与工程校级重点建设学科(kj16zdjsxk02);巢湖学院学科建设质量提升工程项目(kj21kctd03)作者简介:方舒(1982),男,讲师,从事微生物学及毒理学研究。E-mail:。咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的毒性作用和SOD活性的
2、影响方 舒,蔡梦醒,陈梦雅,晏 娟(巢湖学院 生物与环境工程学院,合肥 230000)摘要:目的探究咪唑乙烟酸的毒性作用和抗氧化损伤效应。方法研究咪唑乙烟酸对酵母菌细胞生长、死亡率、细胞截面积、细胞膜通透性、SOD活性和T-AOC的影响。结果咪唑乙烟酸可显著抑制酵母菌细胞生长,且质量浓度越高,抑制效果越显著;细胞死亡率随着药物质量浓度的增加、作用时间的延长而升高;细胞截面积在00.6 g/L质量浓度时呈减小趋势,0.8 g/L质量浓度时,细胞截面积略微增大;细胞膜通透性随着药物质量浓度的增加、作用时间的延长而增大,导致胞外DNA和蛋白质含量增加;细胞SOD活性在00.6 g/L质量浓度时呈上升
3、趋势,0.8 g/L质量浓度时,SOD活性略微下降;细胞T-AOC随着药物质量浓度的增加、作用时间的延长而上升,其中药物处理12 h组较处理24 h组上升趋势显著。结论咪唑乙烟酸可显著抑制酵母菌细胞生长,改变细胞内的SOD活性和T-AOC,对酵母菌具有一定的细胞毒性作用,引发细胞死亡。关键词:咪唑乙烟酸;抑制;酵母菌;细胞毒性;SOD中图分类号:TQ450.2文献标志码:A文章编号:1006-0413(2023)03-0184-06Effects of imazethapyr on yeast cell toxicity and SOD activityFANG Shu,CAI Meng-xi
4、ng,CHEN Meng-ya,YAN Juan(School of Biological and Environmental Engineering,Chaohu University,Hefei 230000,China)Abstract:Aims This study aims to explore the toxic effect and anti-oxidative damage effect of imazethapyr.Methods The effects of imazethapyr on cell growth,mortality,cell profile area,cel
5、l membrane permeability,SODactivity and T-AOC of yeast cells were studied.Results It showed that imazethapyr could significantly inhibit thegrowth of yeast cells,and the inhibitory effect was more significant with the increase of concentration;the cell mortalityincreased with the increase of concent
6、ration and action time;the cell profile area decreased at the concentration of0-0.6 g/L,and increased slightly at the concentration of 0.8 g/L;the membrane permeability increased with the increaseof concentration and action time,resulting in the increase of extracellular DNA and protein content;the
7、SOD activityincreased at the concentration of 0-0.6 g/L and decreased slightly at the concentration of 0.8 g/L;the T-AOC of cellsincreased with the increase of concentration and action time,and the increasing trend of treatment of 12 h group wassignificantly higher than that of treatment of 24 h gro
8、up.Conclusions Imazethapyr could significantly inhibit thegrowth of yeast cells,change the SOD activity and T-AOC,have a certain cytotoxic effect on yeast,and finally inducecell death.Key words:imazethapyr;inhibit;yeast;cytotoxicity;superoxide dismutase咪唑乙烟酸(imazethapyr)是美国氰胺公司于20世纪80年代初开发的咪唑啉酮类除草剂,
9、化学名称(RS)-5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)烟酸,分子式C15H19N3O3,相对分子质量289.3。1993年引 入我国,次年沈阳化工研究院取得该药的原药登记1-3。它主要通过抑制乙酰乳酸合酶来抑制支链氨基酸的生物合成4-5,具有活性高、除草效果好、选择性强等特点,目前主要用于大豆和其他豆类作物的杂草控制,其在当年可降解95%以上,剩余不足5%长期残留在土壤内6-7。酵母菌是一种公认的用于研究生物毒性的模式真核微生物,广泛应用于细胞毒性等研究。有学者研究亚砷酸钠8、氯化1-辛基-3-甲基咪唑9对酵母菌的细胞毒性作用时,结果均显示酵母菌是一种优秀的用于
10、生物毒性测定的受试生物。本试验通过咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的毒性作用和抗氧化损伤效应,丰富咪唑啉酮类除草剂细胞毒性的研究,为探索咪唑乙烟酸的抗氧化损伤效应和环境毒性评价提供更多科学依据。第62卷第3期2023年3月Vol.62,No.3Mar.2023第3期1材料与方法1.1材料1.1.1菌种来源酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae,CCTCC AY92003),中国典型培养物保藏中心。1.1.2供试药剂咪唑乙烟酸(纯度98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.1.3培养基及试剂酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD
11、)培养基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母提取物1%,pH6.0,固体培养基添加2%的琼脂粉,以上均按质量分数计算9;总超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase,T-SOD)试剂盒(货号A001-1-1,南京建成生物工程研究所);总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)试剂盒(货号A015-1-1,南京建成生物工程研究所);酵母细胞蛋白裂解液(生工生物工程股份有限公司);葡萄糖、酵母提取物(国药集团化学试剂有限公司);蛋白胨、琼脂粉(奥博星公司);0.1%吕氏碱性美蓝染色液(海博生物公司)。1.1.4仪器与设备立式压力蒸汽灭菌器(
12、LDZX-50KBS,上海申安医疗器械厂);气浴恒温振荡器(THZ-98B,常州普天仪器制造有限公司);高速冷冻离心机(HC-3016R,安徽中科中佳科学仪器有限公司);超净工作台(SW-CJ-2F,苏州市智拓净化设备科技有限公司);紫外可见分光光度计(TU-1810,北京普析通用仪器有限责任公司);电热鼓风干燥箱(BGZ-70,上海博迅实业有限公司医疗设备厂);生物显微镜(BK6000,重庆奥特光学仪器有限公司)。1.2方法1.2.1受试药物的稀释称取100 mg咪唑乙烟酸用去离子水充分溶解并定容至100 mL,制得1 g/L咪唑乙烟酸储备液。根据预试验分别使用无菌YPD液体培养基配制终质量
13、浓度为0(对照组)、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的咪唑乙烟酸溶液。1.2.2酿酒酵母菌培养酵母菌经种子液活化后,吸取500 L酵母菌液至装有100 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中,30、170 r/min培养至对数生长期,吸取对数生长期酵母菌液作为受试菌株。1.2.3生长曲线测定用100 mL锥形瓶分别配制含0、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L咪唑乙烟酸的YPD液体培养基各50 mL,向瓶里分别加入培养至对数生长期的酵母菌液100 L,每个处理设置3个重复;混匀后,将锥形瓶置于30、170 r/min恒温振荡器上培养,每隔3 h取1次菌液,于600 nm处测定吸光
14、值(OD值),绘制生长曲线;同时分别在培养至12、24 h时取菌液进行细胞死亡率、细胞截面积、细胞膜通透性、SOD活性和T-AOC的测定。1.2.4细胞死亡率测定取咪唑乙烟酸处理12、24 h的菌液25 L分别滴加于洁净载玻片上,再加入等体积的0.1%吕氏碱性美蓝染色液,充分混合后,静置染色5 min,在光学显微镜下进行观察,活细胞为无色,死细胞为蓝色,统计一个视野下死细胞数和细胞总数,按照下面公式计算出酵母菌细胞死亡率。细胞死亡率(%)=死细胞数细胞总数1001.2.5细胞截面积测定取咪唑乙烟酸处理12、24 h的菌液50 L分别滴加于洁净载玻片上,在光学显微镜下观察酵母菌细胞,使用显微镜相
15、机拍照记录细胞形态,通过Image-Pro Plus6.0软件测量图像上随机10个酵母菌细胞的截面积,截面积可以用来表示细胞或细胞器膨大或固缩等形态变化,进而评估细胞受损状况10-11。1.2.6细胞膜通透性测定取培养至对数生长期的菌液,离心后,弃上清液,加入等体积的生理盐水,混匀;按1%(体积分数)稀释,分装于锥形瓶中,各锥形瓶中咪唑乙烟酸的终质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L,30、170 r/min培养12、24 h;培养结束后,6000 r/min离心5 min,取上清液,测定其在波长260、280 nm处的OD值,用于评估细胞膜完整性程度9,12-13。1.2.7S
16、OD活性和T-AOC测定酵母菌细胞酶液的提取方法参照试剂盒说明书和刘向勇14的文献,吸取一定体积菌液于离心管中,8000 r/min离心5 min,弃上清,收集菌体,预冷生理盐水洗涤2次,称湿质量,加入一定体积的酵母细胞蛋白裂解液和少量玻璃珠(直径0.5 mm),涡旋混匀器上振荡30 s,室温下轻轻振荡30 min,-20 下冻融1次,以促进蛋白质完全释放,4、12 000 r/min离心5 min,收集上清液用于后续试验。SOD活性和T-AOC测定均按照厂家试剂盒说明书进行操作。方 舒,等:咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的毒性作用和SOD活性的影响185农 药 AGROCHEMICALS第卷621.
17、2.8数据分析试验中使用GraphPad Prism 8软件、Excel 2019软件对试验数据进行统计分析,当P0.05时表示差异具有统计学意义。2结果与分析2.1咪唑乙烟酸对酵母菌细胞生长的影响由图1可知:在相同的培养条件下,随着咪唑乙烟酸质量浓度的增加,培养相同时间,相较于对照组,药物处理组的OD600值均下降,酵母菌细胞的生长受到了不同程度的抑制,且抑制程度随着药物质量浓度的增加而增大,细胞的生长速率随着药物质量浓度增加而逐渐降低并最终都进入稳定生长期;不同质量浓度处理组随着培养时间的延长,OD600值呈现先增加较快后逐渐平稳;培养615 h后,细胞生长速率较快,15 h后生长速率缓慢
18、,615 h为该处理条件下酵母菌细胞的对数生长期,18 h后为稳定生长期。咪唑乙烟酸可抑制酵母菌细胞的生长,并具有一定的浓度依赖性。2.2咪唑乙烟酸对酵母菌细胞死亡率的影响为证实咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的毒性作用,采用碱性美蓝染色法对细胞活性进行观测,结果见图2。由图3可知:在相同作用时间下,随着咪唑乙烟酸质量浓度的增加,细胞死亡率逐渐升高;在相同的咪唑乙烟酸质量浓度下,随着作用时间的延长,细胞死亡率也在逐渐升高;不同质量浓度咪唑乙烟酸作用12 h后,各药物处理组相较于对照组,细胞死亡率显著升高,且药物质量浓度越高越显著;不同质量浓度咪唑乙烟酸作用24 h后,随着咪唑乙烟酸质量浓度的增加,细胞死
19、亡率趋于线性增长,逐渐升高。以上结果说明,在短时间内,低质量浓度咪唑乙烟酸对酵母菌细胞死亡率没有明显作用,但随着作用时间的延长,诱导酵母菌细胞死亡作用逐渐明显,存在时间效应;高质量浓度咪唑乙烟酸对酵母菌细胞死亡率影响,短时间作用显著,随着作用时间的延长,作用效果依旧;咪唑乙烟酸低质量浓度长时间作用或高质量浓度短时间作用都对酵母菌细胞产生毒性作用,致使细胞死亡。2.3咪唑乙烟酸对酵母菌细胞截面积的影响细胞在进行增殖分裂时,需要进行一系列的物质准备,如进行DNA复制和蛋白质合成,以保证自身足够进入下一细胞周期。细胞通过精确合成细胞组分来进行增殖分裂,其中包括线粒体、液泡、细胞膜等15。细胞组分的合
20、成与分布受细胞的严格调控,进而影响细胞大小及形态等,细胞截面积可以定量表示细胞形态变化,进而评估细胞受损状况。由图4可知:在咪唑乙烟酸作用12、24 h后,00.6 g/L质量浓度范围内,随着咪唑乙烟酸质量浓度的增加,细胞截面积总体上呈减小趋势;在0.8 g/L质量浓度下,细胞截面积略微增大。咪唑乙烟酸在低、高质量浓度作用时,均显著影响酵母菌细胞截面积,进而影响到细胞形态和功能,且在高质量浓度作用时影响更明显。图1咪唑乙烟酸对酵母菌细胞生长的影响A.对照组酵母菌细胞;B.0.8 g/L咪唑乙烟酸处理酵母菌细胞12 h图2咪唑乙烟酸对酵母菌细胞的致死效应注:*表示P0.01,药物处理组与对照组相
21、差极显著。图3咪唑乙烟酸对酵母菌细胞死亡率的影响注:*表示P0.05),经中高质量浓度0.40.8 g/L处理12、24 h后,细胞的T-AOC有显著升高,T-AOC总体上随着咪唑乙烟酸质量浓度的增加呈上升趋势,0.8 g/L处理组T-AOC最高;咪唑乙烟酸处理12 h后T-AOC的上升趋势要比处理24 h后的T-AOC上升趋势更加显著,高质量浓度处理组(0.6、0.8 g/L)处理24 h后的T-AOC相较于培养12 h时升高缓慢,但仍显著高于对照组。3讨论与结论酵母菌作为一种重要的模式生物,被广泛应用于现代生物学研究中16。试验揭示了不同质量浓度、不同作用时间的咪唑乙烟酸对酵母菌细胞毒性和
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