miR-103及其靶基因Cav1.2在低氧预适应提升小鼠学习记忆中的表达.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目(,),内蒙古自然科学基金项目(),内蒙古自治区高等学校科学研究项目(),包头医学院创新团队发展计划项目(),包头医学院花蕾计划项目通讯作者:谢伟,谢雅彬【基础医学】及其靶基因 在低氧预适应提升小鼠学习记忆中的表达翁清明,王蒙,谢伟,谢雅彬,(包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室,内蒙古 包头 ;包头医学院基础医学与法医学院;包头医学院医学技术与麻醉学院神经科学研究所)摘要 目的:探究 和 在低氧预适应改善学习记忆能力中的表达变化,阐明 调控 在低氧预适应内源性神经保护中的作用机制。方法:使用 雄性小鼠作为实验对象,构建正常组()、低氧组()、低氧预适应组
2、(),通过 水迷宫分别评估各组小鼠的学习记忆能力;通过 和 技术检测小鼠海马组织中 和 的表达变化,通过双荧光素酶报告基因检测 和 之间的调控关系。结果:小鼠随着低氧次数的增加,低氧耐受时间显著增强。与 组相比,组小鼠的潜伏期时间明显降低(),目标象限时间的百分比增加(),平台穿越次数明显增加()。与 组相比,组小鼠海马组织中 在第 表达下调()。通过与 的 结合从而靶向 。与 组相比,组小鼠海马组织中 蛋白在第 表达升高()。结论:低氧预适应下调 表达,从而上调 下游靶基因 的表达,最终提升小鼠低氧耐受能力和认知功能。关键词 低氧预适应;小鼠;学习记忆 :,(,;,;,):,:(),()()
3、,年第 卷第 期 ;,:,(),(),(),(),():,;低氧预适应(,)为机体组织细胞的一种“获得性耐受”,是指生物体、器官、组织或细胞暴露于非损伤性、重复性轻度或中度缺氧条件下,使机体对后续更为严重的缺氧产生耐受性 。是机体的一种内源性神经保护机制,其具体分子机制还不明确,但是其很可能通过表观遗传学发挥作用,而 是表观遗传学重要组成部分。()是一种小的、高度保守的内源性非编码单链 ,通过与靶 的 非翻译区结合,负调节 表达,并在转录后基因表达调控中发挥作用 。可以通过靶向阿尔茨海默病(,)细胞模型中的前列腺素内过氧化物合酶 ,促进神经突生长和抑制细胞凋亡,而且 的表达与阿尔茨海默病患者的
4、痴呆严重程度呈负相关,这些研究揭示了 作为 疾病风险和疾病进展的生物标志物的潜能 ,并可能通过调节下游靶基因影响认知功能。此外,是 型电压门控钙通道主要的组成部分,在哺乳动物大脑中广泛表达,基因是 的 主 要 编 码 基因 。研究发现,在海马和新皮质中 基因失活的小鼠表现出海马依赖的空间记忆严重受损 。而且 还参与海马长时程增强(,)的形成。即 可能通过调节 影响学习记忆。在本研究中,首先通过对 处理后表达产生变化并可能与学习记忆有关的 进行筛选,确定 下游靶基因 。而鉴于 又与学习记忆有关,因此进一步探究 和 在低氧预适应改善学习记忆能力中的表达变化,以阐明 调控 在低氧预适应内源性神经保护
5、中的作用机制。材料与方法 实验动物 雄性小鼠,周、体重 ,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司 (京)。本研究经包头医学院批准,小鼠在动物房进行饲养以及后续的解剖,并按照中国实验动物相关规定及原则给予人道处理。仪器与试剂超声波破碎仪(,),离心机(,),恒温摇床(国华企业集团有限公司,),酶标仪(,),电泳仪(,),化学发光成像仪(上海天能科技有限公司,),超净工作台(,),实时荧光定量 仪(,),浓 度 定 量 试 剂 盒(,),抗氧化剂(,),组织裂解 液(,),膜(,),(,),抽提试剂盒 生工生物工程(上海)股份有 年第 卷第 期 限公司,第一链 合成(加尾法)试剂盒 生工生物工程(上海
6、)股份有限公司,(康为世纪生物科技有限公司,)等。低氧预适应模型的建立小鼠称重,选取质量范围在 的小鼠进行分组:对照组()、低氧组()、低氧预适应组()。构建低氧模型,首先将小鼠放入 的透明玻璃的广口瓶中,塞紧橡胶塞,用计时器立刻计时并观察小鼠的呼吸及生理状态。当小鼠达到低氧非致死状态时,即小鼠出现大口喘气并且仰式卧位,同时身体出现痉挛以及大小便失禁的情况,迅速拔下橡胶塞,快速取出小鼠并实施抢救,记下其耐受时间,记实验小鼠为 次低氧小鼠。重复上述步骤,共 次,即为低氧预适应模型小鼠。只进行 次低氧的小鼠为低氧组。未进行低氧的小鼠为对照组。水迷宫实验使用 水迷宫测试小鼠的空间学习和记忆能力。对照
7、组()、低氧组()、低氧预适应组()每组各 只小鼠。首先将小鼠分别放入水池中 ,进行自由游泳以适应环境。第 将平台放入 象限,将小鼠面朝池壁放入水中进行训练,每个象限各 次,每 次,共。当小鼠在 内找到平台并在平台上停留即为训练成功,如 内找不到平台的小鼠,将由实验员用木棍引导小鼠到平台上停留 ,时间记为 ,即为小鼠的潜伏期。反复上述实验,共。第 将水池中的跳台撤去,任选一个象限放入小鼠(所有小鼠入水点相同),记录穿梭平台区域次数以及目标象限停留时间百分比。实时荧光定量 使用 柱式 抽提试剂盒提取小鼠海马的总 ,并使用 第一链 合成(加尾法)试剂盒反转录为 。使用 和 系统进行。用 方法计算相
8、对 水平,归一化为 。电泳剥离各组小鼠海马于冰上融化后,加入 的 裂解液和 蛋白酶抑制剂后超声破碎,将样品放入 低温离心机中 离心 ,将上清液转移到新的 管中,使用 试剂盒确定蛋白浓度。电泳上样质量为 ,的浓缩胶使用 ,分离胶使用 ;使用快速转膜液 转膜 。使用的脱脂牛奶封闭 ,清洗次,每次 。过夜孵育一抗();清洗 次,每次 ;使用山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗()孵育 ;清洗 次,每次 。使用 超敏发光液检测蛋白条带。荧光素酶报告实验将 的野生型()和突变型()结合位点分别亚克隆到 载体中,构建 。然后,将 或 与 模拟物或 模拟物共转染 细胞,用双荧光素酶测定系统评估荧光素酶活性。统计学分析使
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