基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计_于筱溪.pdf
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1、 实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 4 期 2023 年 4 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.4 Apr.2023 收稿日期:2022-10-22 基金项目:国家自然科学基金项目(22178387)作者简介:于筱溪(1988),女,天津,博士,副教授,主要从事蛋白质组装相关领域研究,。引文格式:于筱溪,蒋勋涛,吴霞.基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计J.实验技术与管理,2023,40(4):108-113.Cite this article:YU X X,JIANG X T,WU X.Comprehensi
2、ve experiment design of protein crystallization regulation based on non-covalent interactionJ.Experimental Technology and Management,2023,40(4):108-113.(in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.04.015 基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 于筱溪,蒋勋涛,吴 霞(中国石油大学(华东)化学化工学院,山东 青岛 266580)摘 要:该文设计了通过非共价
3、作用调控蛋白质结晶的综合实验。实验以离子液体为添加剂,通过晶体形貌、结晶动力学等表征蛋白质的结晶过程,并在此基础上,通过 Zeta 电势等探究离子液体与蛋白质之间的非共价相互作用,揭示其调控结晶作用机制。该实验能够帮助学生更好地了解蛋白质的结晶过程,探究离子液体与蛋白质的作用过程,掌握非共价相互作用相关理论,在提高动手能力的同时,激发学习热情与创新思维。关键词:非共价作用;蛋白质结晶;机制 中图分类号:TQ423.9 文献标识码:A 文章编号:1002-4956(2023)04-0108-06 Comprehensive experiment design of protein crystal
4、lization regulation based on non-covalent interaction YU Xiaoxi,JIANG Xuntao,WU Xia(College of Chemistry and Chemical Engineering,China University of Petroleum(East China),Qingdao 266580,China)Abstract:In this paper,a comprehensive experiment was designed to regulate protein crystallization through
5、non-covalent interaction.Using ionic liquids as additives,protein crystallization was characterized by crystal morphology and crystallization kinetics.In addition,the non-covalent interaction between ionic liquids and protein was explored by Zeta potential,and the mechanism of crystallization regula
6、tion was revealed.This experiment can help students better understand the crystallization process of protein,explore the interaction between ionic liquid and protein,master the theory of non-covalent interaction,and stimulate learning enthusiasm and innovative thinking while improving manual dexteri
7、ty.Key words:non-covalent interaction;protein crystallization;mechanism 蛋白质广泛存在于所有生物体中,直接参与生命体重要的生理生化过程1。蛋白质结晶技术始于 1840年,是蛋白质三维结构解析、蛋白质纯化等方面研究的重要手段。迄今为止,蛋白质数据库(protein data bank,PDB)收录的蛋白质三维结构中,有 80%以上是通过 X 射线晶体衍射解析得到的。由于结晶过程受到温度、pH、浓度、离子强度、沉淀剂种类等多种因素影响,现阶段蛋白质结晶仍然是一个“半经验”过程,成功率较低。蛋白质结晶是蛋白质分子从杂乱无章的状态
8、进行有规则排列的过程,以过饱和度为推动力,主要包括成核与生长两个阶段2。成核是结晶过程的第一步,也是最为重要但却最为困难的一步。由于蛋白质分子扩散速率慢,聚集成核需要克服较高的能垒,因此蛋白质结晶通常需要较大的推动力,即较高的过饱和度。但溶液过饱和度的提高,容易引起蛋白质杂乱聚集而形成沉淀。如何有效调控蛋白质聚集成核是蛋白质结晶研究的热点课题。蛋白质晶核是在非共价相互作用驱动下自发形成的聚集体,与蛋白质的性质有密切关系。通过引入添加剂分子改变蛋白质分子间的非共价相互作用,是调控蛋白质成核,培养高质量蛋白质晶体的重要方法3。于筱溪,等:基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 109 离子液体是
9、由有机阳离子、有机或无机阴离子构成的,在室温下为呈液态的有机盐,具有非挥发性及良好的化学与热稳定性4-5。此外,离子液体的生物相容性高,可维持蛋白质的三维结构,其亲疏水性可通过选择不同的阴阳离子进行调节6-8。因此,将离子液体作为添加剂,通过非共价相互作用与蛋白质结合,有望实现对蛋白质之间非共价相互作用的调控,对促进蛋白质结晶具有重要意义。本实验基于非共价相互作用,通过离子液体调控蛋白质结晶,并通过多种表征手段阐明离子液体调控蛋白质结晶的作用机制。首先配制不同亲疏水性的离子液体溶液,进行电导率测定,明确离子液体的临界胶束浓度和亲疏水性。在此基础上,配制含有离子液体的蛋白质结晶溶液,考察离子液体
10、对蛋白质晶体形貌和结晶动力学的影响。最后,通过 Zeta 电势探究离子液体与蛋白质的非共价相互作用,阐明离子液体调控蛋白质结晶的作用机制。1 实验部分 1.1 实验目的(1)掌握电导率测定离子液体的临界胶束浓度原理与方法。(2)掌握蛋白质结晶的原理与方法。(3)掌握紫外分光光度计法测定蛋白质浓度的原理与方法。(4)了解纳米粒度分析仪的原理与使用方法。1.2 实验药品与实验仪器 实验药品:鸡蛋清溶菌酶(纯度 98%,Sigma),1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C2mimBF4,99%,上海成捷化学),溴化 1-乙基-3 甲基咪唑(C2mimBr,99%,上海成捷化学),溴化 1-己基-3 甲
11、基咪唑(C6mimBr,99%,上海成捷化学),超纯水,氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),乙酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。实验仪器:电导率仪,紫外分光光度计,倒置荧光显微镜,纳米粒度分析仪,容量瓶,量筒,pH 计,电子分析天平,离心管,移液枪,一次性枪头,96 孔细胞培养板。1.3 溶液配制 1)离子液体溶液。以C6mimBr 为例,首先配制 1 mol/L 离子液体母液,称取 12.7 g C6mimBr,用超纯水溶解,容量瓶定容至 50 mL 备用。将C6mimBr 母液分别稀释至不同浓度,用于电导率测量,不同溶液配比如表
12、1 所示。表 1 测定C6mimBr 临界胶束浓度的溶液浓度 管号 样品 1 2 3 4 567C6mimBr 母液/mL 0.2 0.6 1 2 3 5 7 超纯水/mL 9.8 9.4 9 8 7 5 3 C6mimBr 终浓度/molmL10.02 0.06 0.1 0.2 0.30.50.7 C2mimBF4溶液与C2mimBr 溶液的配制方法同上。2)醋酸-醋酸钠缓冲溶液。结晶实验在 pH=4.5、1 mol/L 的醋酸钠缓冲溶液中进行,缓冲溶液的配制过程如下:(1)称取 2.0 g 氢氧化钠固体于小烧杯中,向小烧杯中加入 50 mL 超纯水溶解,摇匀备用。(2)称取 6.005 g
13、 冰醋酸,在烧杯中加入 50 mL超纯水溶解。(3)将 pH 计电极置于醋酸溶液中,一边搅拌一边加入配好的氢氧化钠溶液,至 pH=4.5。(4)将配好的醋酸钠溶液定容至 1 000 mL,移到贴好标签的玻璃瓶中备用。3)溶菌酶结晶溶液配制。(1)溶菌酶母液。以 20 mg/mL 为例,称取溶菌酶 1.0 g,用醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解,容量瓶定容至 50 mL 备用。按照同样方法再配制两种溶菌酶母液(30 mg/mL 和 40 mg/mL)备用。(2)氯化钠母液。称取氯化钠 4.0 g,用醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解,容量瓶定容至 50 mL 备用。(3)离子液体母液。以 6 mol/L C6mi
14、mBr 为例,称取 76.22 g C6mimBr,用超纯水溶解,容量瓶定容至50 mL,再用缓冲溶液将离子液体母液分别稀释到不同的浓度备用。按照同样方法配制 6 mol/L C2mimBF4溶液和 6 mol/L C2mimBr 溶液,稀释后备用。1.4 实验方法 1)电导率法测定离子液体临界胶束浓度。(1)以C6mimBr 为例,取 7 个 15 mL 玻璃瓶,分别编号后加入表 1 中不同浓度的C6mimBr 溶液。(2)开启电导率仪,用标准溶液校准。(3)选择 mS/cm 模式,依次检测各C6mimBr 溶液的电导率。(4)测定时要注意避免溶液内出现气泡。待电导率数据稳定后,记录数据。每
15、个样品重复测量三次。(5)对电导率与C6mimBr 浓度做图并拟合,得到一条由两段不同斜率的直线组成的曲线,斜率分别为 S1和 S2,两段直线交点的浓度即为临界胶束浓度。2)溶菌酶结晶。(1)溶菌酶结晶实验在醋酸-醋酸钠缓冲溶液体系中进行,利用 96 孔细胞培养板考察溶菌酶结晶过程。110 实 验 技 术 与 管 理 向孔板中依次加入 100 L 溶菌酶溶液、100 L 氯化钠溶液和 10 L 离子液体溶液,如表 2 所示。表 2 结晶溶液组成配比 单位:L 溶菌酶溶液 氯化钠 离子液体 缓冲溶液对照组 100 100 0 10+C2mimBF4 100 100 10 0+C2mimBr 10
16、0 100 10 0+C6mimBr 100 100 10 0 (2)实验所考察的浓度范围,蛋白质浓度梯度为10 mg/mL、15 mg/mL 和 20 mg/mL,离子液体浓度梯度为 0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L 和 0.3 mol/L。氯化钠质量分数为 4%。(3)将细胞板置于 4 冰箱中,24 h 后用倒置荧光显微镜观察结晶情况。3)溶菌酶浓度测定。(1)采用紫外-可见光谱法测定溶菌酶的浓度。按照本文 1.3 节中的方法,分别配制溶菌酶标准溶液0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/
17、mL,选择醋酸-醋酸钠缓冲溶液作为溶剂。(2)打开紫外分光光度计,预热 30 min,设置测量步长为 1 nm,狭缝宽度为 1 nm,测量速度中等,选用光程为 1 cm 的石英比色皿。先以乙酸钠缓冲液为空白进行基线校准和调零,再测定溶菌酶标准溶液在280 nm 处的吸光值。(3)做溶菌酶吸光度与溶液浓度关系图,得到溶菌酶标准曲线。测定未知浓度溶菌酶样品在 280 nm 下的吸光度值,带入标准曲线中,换算得到溶菌酶样品的浓度。4)溶菌酶结晶动力学测定。(1)本部分实验均是在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中进行,首先配制溶菌酶结晶母液,浓度为溶菌酶20 mg/mL,氯化钠质量分数 4%。(2)将结晶母液平均
18、分成 4 份,向其中分别加入不同浓度的离子液体溶液,离子液体的最终浓度分别为 0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L。所考察的离子液体分别为C2mimBF4、C2mimBr、C6mimBr。(3)使配置好的溶液温度为 4,然后开始计时,同时取刚配好的溶液作为 0 时刻的样品。(4)每隔 4 h,取 500 L 溶菌酶结晶溶液,在转速14 000 r/min条件下,离心15 min后,取上清液25 L稀释,测定溶菌酶浓度,整理得到溶菌酶结晶过程动力学曲线。5)溶液电势测定。(1)采用超纯水+溶菌酶+离子液体体系,按比例分别配制不同浓度的混合溶液,并以仅添加超纯
19、水的溶菌酶溶液作为对照组,溶液总体积为 1 mL。混合溶液中离子液体的浓度梯度为 0 mol/L、0.02 mol/L、0.06 mol/L、0.1 mol/L、0.16 mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L、0.3 mol/L。(2)配制完成后分别用注射器将结晶溶液通过0.22 m 孔径的滤膜过滤,去除溶液中未溶解的杂质。(3)打开纳米粒度分析仪,预热 30 min,将待测溶液放入微量样品池中,选择 Size 界面,测量模式选manual measurement,依次设置测量溶液的溶剂、样品池型号、测量循环次数等参数。(4)选 择 Zeta 界 面,测 量 模 式 选 man
20、ual measurement,设置测量参数,选择 DTS1060 样品池。多次重复测量,至数据趋于平稳,即得到溶液的 Zeta电势。2 结果与讨论 2.1 离子液体的亲疏水性表征 为了能在溶液中稳定存在,当浓度增大到一定值时,表面活性剂离子在溶液内部会以疏水基团形式互相靠拢,聚集在一起形成胶束,形成胶束时的浓度即为临界胶束浓度(CMC)。CMC 是表面活性剂的一种重要量度,由于溶液结构发生了改变,表面活性剂溶液的性质也会随胶束的出现而发生改变9。为了明确离子液体的亲疏水性,本实验利用电导率法检测了离子液体的 CMC,如图 1 所示。对于浓度低于 CMC 的离子液体溶液,其电导率变化规律与强
21、图 1 不同离子液体的电导率随浓度的变化趋势 于筱溪,等:基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 111 电解质一样,随浓度升高而线性增加。当溶液浓度达到 CMC 时,随着溶液中离子液体浓度的增加,胶束的数量增加。由于胶束对溶液中的电导贡献微小,电导率随浓度的增加趋势会有所减慢,拐点即为离子液体的 CMC。经过拟合计算可以得到三种离子液体的 CMC,列于表 3 中。C6mimBr 的临界胶束浓度明显小于其他两种离子液体的临界胶束浓度,表明其疏水性更强。C2mimBF4的结构与具有芳香环阳离子的传统疏水盐结构类似10,因此其疏水性强于C2mimBr。表 3 不同种类离子液体的临界胶束浓度 离子
22、液体 CMC/(molL1)C2mimBF4 0.222 9 C2mimBr 0.269 0 C6mimBr 0.181 3 上述结果表明,实验考察的三种离子液体具有不同的亲疏水性,说明其与蛋白质间的非共价相互作用的强度不同,因此推测其调控蛋白质结晶过程的结果不同,对此需要进一步进行探究。2.2 离子液体对蛋白质晶体形貌的影响 蛋白质分子量越大,聚集倾向越弱,相较小分子的结晶过程就越缓慢,且成功率越低。通过添加剂调控蛋白质分子间的非共价相互作用,是促进蛋白质结晶的一个有效手段。本文研究考察了不同离子液体诱导蛋白质结晶过程。选用溶菌酶作为研究对象,所得晶体的显微镜照片如图 2、图 3、图 4 所
23、示(比例尺 100 m;溶菌酶浓度 10 mg/mL;氯化钠质量分数 4%)。通过显微镜照片可以发现,在实验考察的浓度范围内,溶菌酶可以 注:(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的C2mimBF4浓度分别为 0、0.02、0.1、0.12、0.2、0.3 mol/L。图 2 不同浓度的C2mimBF4诱导下 溶菌酶晶体的显微镜照片 注:(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的C2mim Br 浓度分别为 0、0.06、0.1、0.12、0.2、0.3 mol/L。图 3 不同浓度的C2mimBr 下溶菌酶晶体的显微镜照片 注:(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的C
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- 基于 共价 作用 调控 蛋白质 结晶 综合 实验设计
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