基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计_于筱溪.pdf

实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 4 期 2023 年 4 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.4 Apr.2023 收稿日期:2022-10-22 基金项目:国家自然科学基金项目（22178387）作者简介:于筱溪（1988），女，天津，博士，副教授，主要从事蛋白质组装相关领域研究，。引文格式:于筱溪，蒋勋涛，吴霞.基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计J.实验技术与管理,2023,40(4):108-113.Cite this article:YU X X,JIANG X T,WU X.Comprehensive experiment design of protein crystallization regulation based on non-covalent interactionJ.Experimental Technology and Management,2023,40(4):108-113.(in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.04.015 基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 于筱溪，蒋勋涛，吴 霞（中国石油大学（华东）化学化工学院，山东 青岛 266580）摘 要：该文设计了通过非共价作用调控蛋白质结晶的综合实验。实验以离子液体为添加剂，通过晶体形貌、结晶动力学等表征蛋白质的结晶过程，并在此基础上，通过 Zeta 电势等探究离子液体与蛋白质之间的非共价相互作用，揭示其调控结晶作用机制。该实验能够帮助学生更好地了解蛋白质的结晶过程，探究离子液体与蛋白质的作用过程，掌握非共价相互作用相关理论，在提高动手能力的同时，激发学习热情与创新思维。关键词：非共价作用；蛋白质结晶；机制 中图分类号：TQ423.9 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2023)04-0108-06 Comprehensive experiment design of protein crystallization regulation based on non-covalent interaction YU Xiaoxi,JIANG Xuntao,WU Xia(College of Chemistry and Chemical Engineering,China University of Petroleum(East China),Qingdao 266580,China)Abstract:In this paper,a comprehensive experiment was designed to regulate protein crystallization through non-covalent interaction.Using ionic liquids as additives,protein crystallization was characterized by crystal morphology and crystallization kinetics.In addition,the non-covalent interaction between ionic liquids and protein was explored by Zeta potential,and the mechanism of crystallization regulation was revealed.This experiment can help students better understand the crystallization process of protein,explore the interaction between ionic liquid and protein,master the theory of non-covalent interaction,and stimulate learning enthusiasm and innovative thinking while improving manual dexterity.Key words:non-covalent interaction;protein crystallization;mechanism 蛋白质广泛存在于所有生物体中，直接参与生命体重要的生理生化过程1。蛋白质结晶技术始于 1840年，是蛋白质三维结构解析、蛋白质纯化等方面研究的重要手段。迄今为止，蛋白质数据库（protein data bank，PDB）收录的蛋白质三维结构中，有 80%以上是通过 X 射线晶体衍射解析得到的。由于结晶过程受到温度、pH、浓度、离子强度、沉淀剂种类等多种因素影响，现阶段蛋白质结晶仍然是一个“半经验”过程，成功率较低。蛋白质结晶是蛋白质分子从杂乱无章的状态进行有规则排列的过程，以过饱和度为推动力，主要包括成核与生长两个阶段2。成核是结晶过程的第一步，也是最为重要但却最为困难的一步。由于蛋白质分子扩散速率慢，聚集成核需要克服较高的能垒，因此蛋白质结晶通常需要较大的推动力，即较高的过饱和度。但溶液过饱和度的提高，容易引起蛋白质杂乱聚集而形成沉淀。如何有效调控蛋白质聚集成核是蛋白质结晶研究的热点课题。蛋白质晶核是在非共价相互作用驱动下自发形成的聚集体，与蛋白质的性质有密切关系。通过引入添加剂分子改变蛋白质分子间的非共价相互作用，是调控蛋白质成核，培养高质量蛋白质晶体的重要方法3。于筱溪，等：基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 109 离子液体是由有机阳离子、有机或无机阴离子构成的，在室温下为呈液态的有机盐，具有非挥发性及良好的化学与热稳定性4-5。此外，离子液体的生物相容性高，可维持蛋白质的三维结构，其亲疏水性可通过选择不同的阴阳离子进行调节6-8。因此，将离子液体作为添加剂，通过非共价相互作用与蛋白质结合，有望实现对蛋白质之间非共价相互作用的调控，对促进蛋白质结晶具有重要意义。本实验基于非共价相互作用，通过离子液体调控蛋白质结晶，并通过多种表征手段阐明离子液体调控蛋白质结晶的作用机制。首先配制不同亲疏水性的离子液体溶液，进行电导率测定，明确离子液体的临界胶束浓度和亲疏水性。在此基础上，配制含有离子液体的蛋白质结晶溶液，考察离子液体对蛋白质晶体形貌和结晶动力学的影响。最后，通过 Zeta 电势探究离子液体与蛋白质的非共价相互作用，阐明离子液体调控蛋白质结晶的作用机制。1 实验部分 1.1 实验目的（1）掌握电导率测定离子液体的临界胶束浓度原理与方法。（2）掌握蛋白质结晶的原理与方法。（3）掌握紫外分光光度计法测定蛋白质浓度的原理与方法。（4）了解纳米粒度分析仪的原理与使用方法。1.2 实验药品与实验仪器 实验药品：鸡蛋清溶菌酶（纯度 98%，Sigma），1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（C2mimBF4，99%，上海成捷化学），溴化 1-乙基-3 甲基咪唑（C2mimBr，99%，上海成捷化学），溴化 1-己基-3 甲基咪唑（C6mimBr，99%，上海成捷化学），超纯水，氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。实验仪器：电导率仪，紫外分光光度计，倒置荧光显微镜，纳米粒度分析仪，容量瓶，量筒，pH 计，电子分析天平，离心管，移液枪，一次性枪头，96 孔细胞培养板。1.3 溶液配制 1）离子液体溶液。以C6mimBr 为例，首先配制 1 mol/L 离子液体母液，称取 12.7 g C6mimBr，用超纯水溶解，容量瓶定容至 50 mL 备用。将C6mimBr 母液分别稀释至不同浓度，用于电导率测量，不同溶液配比如表 1 所示。表 1 测定C6mimBr 临界胶束浓度的溶液浓度 管号 样品 1 2 3 4 567C6mimBr 母液/mL 0.2 0.6 1 2 3 5 7 超纯水/mL 9.8 9.4 9 8 7 5 3 C6mimBr 终浓度/molmL10.02 0.06 0.1 0.2 0.30.50.7 C2mimBF4溶液与C2mimBr 溶液的配制方法同上。2）醋酸-醋酸钠缓冲溶液。结晶实验在 pH=4.5、1 mol/L 的醋酸钠缓冲溶液中进行，缓冲溶液的配制过程如下：（1）称取 2.0 g 氢氧化钠固体于小烧杯中，向小烧杯中加入 50 mL 超纯水溶解，摇匀备用。（2）称取 6.005 g 冰醋酸，在烧杯中加入 50 mL超纯水溶解。（3）将 pH 计电极置于醋酸溶液中，一边搅拌一边加入配好的氢氧化钠溶液，至 pH=4.5。（4）将配好的醋酸钠溶液定容至 1 000 mL，移到贴好标签的玻璃瓶中备用。3）溶菌酶结晶溶液配制。（1）溶菌酶母液。以 20 mg/mL 为例，称取溶菌酶 1.0 g，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，容量瓶定容至 50 mL 备用。按照同样方法再配制两种溶菌酶母液（30 mg/mL 和 40 mg/mL）备用。（2）氯化钠母液。称取氯化钠 4.0 g，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，容量瓶定容至 50 mL 备用。（3）离子液体母液。以 6 mol/L C6mimBr 为例，称取 76.22 g C6mimBr，用超纯水溶解，容量瓶定容至50 mL，再用缓冲溶液将离子液体母液分别稀释到不同的浓度备用。按照同样方法配制 6 mol/L C2mimBF4溶液和 6 mol/L C2mimBr 溶液，稀释后备用。1.4 实验方法 1）电导率法测定离子液体临界胶束浓度。（1）以C6mimBr 为例，取 7 个 15 mL 玻璃瓶，分别编号后加入表 1 中不同浓度的C6mimBr 溶液。（2）开启电导率仪，用标准溶液校准。（3）选择 mS/cm 模式，依次检测各C6mimBr 溶液的电导率。（4）测定时要注意避免溶液内出现气泡。待电导率数据稳定后，记录数据。每个样品重复测量三次。（5）对电导率与C6mimBr 浓度做图并拟合，得到一条由两段不同斜率的直线组成的曲线，斜率分别为 S1和 S2，两段直线交点的浓度即为临界胶束浓度。2）溶菌酶结晶。（1）溶菌酶结晶实验在醋酸-醋酸钠缓冲溶液体系中进行，利用 96 孔细胞培养板考察溶菌酶结晶过程。110 实 验 技 术 与 管 理 向孔板中依次加入 100 L 溶菌酶溶液、100 L 氯化钠溶液和 10 L 离子液体溶液，如表 2 所示。表 2 结晶溶液组成配比 单位：L 溶菌酶溶液 氯化钠 离子液体 缓冲溶液对照组 100 100 0 10+C2mimBF4 100 100 10 0+C2mimBr 100 100 10 0+C6mimBr 100 100 10 0 （2）实验所考察的浓度范围，蛋白质浓度梯度为10 mg/mL、15 mg/mL 和 20 mg/mL，离子液体浓度梯度为 0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L 和 0.3 mol/L。氯化钠质量分数为 4%。（3）将细胞板置于 4 冰箱中，24 h 后用倒置荧光显微镜观察结晶情况。3）溶菌酶浓度测定。（1）采用紫外-可见光谱法测定溶菌酶的浓度。按照本文 1.3 节中的方法，分别配制溶菌酶标准溶液0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/mL，选择醋酸-醋酸钠缓冲溶液作为溶剂。（2）打开紫外分光光度计，预热 30 min，设置测量步长为 1 nm，狭缝宽度为 1 nm，测量速度中等，选用光程为 1 cm 的石英比色皿。先以乙酸钠缓冲液为空白进行基线校准和调零，再测定溶菌酶标准溶液在280 nm 处的吸光值。（3）做溶菌酶吸光度与溶液浓度关系图，得到溶菌酶标准曲线。测定未知浓度溶菌酶样品在 280 nm 下的吸光度值，带入标准曲线中，换算得到溶菌酶样品的浓度。4）溶菌酶结晶动力学测定。（1）本部分实验均是在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中进行，首先配制溶菌酶结晶母液，浓度为溶菌酶20 mg/mL，氯化钠质量分数 4%。（2）将结晶母液平均分成 4 份，向其中分别加入不同浓度的离子液体溶液，离子液体的最终浓度分别为 0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L。所考察的离子液体分别为C2mimBF4、C2mimBr、C6mimBr。（3）使配置好的溶液温度为 4，然后开始计时，同时取刚配好的溶液作为 0 时刻的样品。（4）每隔 4 h，取 500 L 溶菌酶结晶溶液，在转速14 000 r/min条件下，离心15 min后，取上清液25 L稀释，测定溶菌酶浓度，整理得到溶菌酶结晶过程动力学曲线。5）溶液电势测定。（1）采用超纯水+溶菌酶+离子液体体系，按比例分别配制不同浓度的混合溶液，并以仅添加超纯水的溶菌酶溶液作为对照组，溶液总体积为 1 mL。混合溶液中离子液体的浓度梯度为 0 mol/L、0.02 mol/L、0.06 mol/L、0.1 mol/L、0.16 mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L、0.3 mol/L。（2）配制完成后分别用注射器将结晶溶液通过0.22 m 孔径的滤膜过滤，去除溶液中未溶解的杂质。（3）打开纳米粒度分析仪，预热 30 min，将待测溶液放入微量样品池中，选择 Size 界面，测量模式选manual measurement，依次设置测量溶液的溶剂、样品池型号、测量循环次数等参数。（4）选 择 Zeta 界 面，测 量 模 式 选 manual measurement，设置测量参数，选择 DTS1060 样品池。多次重复测量，至数据趋于平稳，即得到溶液的 Zeta电势。2 结果与讨论 2.1 离子液体的亲疏水性表征 为了能在溶液中稳定存在，当浓度增大到一定值时，表面活性剂离子在溶液内部会以疏水基团形式互相靠拢，聚集在一起形成胶束，形成胶束时的浓度即为临界胶束浓度（CMC）。CMC 是表面活性剂的一种重要量度，由于溶液结构发生了改变，表面活性剂溶液的性质也会随胶束的出现而发生改变9。为了明确离子液体的亲疏水性，本实验利用电导率法检测了离子液体的 CMC，如图 1 所示。对于浓度低于 CMC 的离子液体溶液，其电导率变化规律与强 图 1 不同离子液体的电导率随浓度的变化趋势 于筱溪，等：基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 111 电解质一样，随浓度升高而线性增加。当溶液浓度达到 CMC 时，随着溶液中离子液体浓度的增加，胶束的数量增加。由于胶束对溶液中的电导贡献微小，电导率随浓度的增加趋势会有所减慢，拐点即为离子液体的 CMC。经过拟合计算可以得到三种离子液体的 CMC，列于表 3 中。C6mimBr 的临界胶束浓度明显小于其他两种离子液体的临界胶束浓度，表明其疏水性更强。C2mimBF4的结构与具有芳香环阳离子的传统疏水盐结构类似10，因此其疏水性强于C2mimBr。表 3 不同种类离子液体的临界胶束浓度 离子液体 CMC/(molL1)C2mimBF4 0.222 9 C2mimBr 0.269 0 C6mimBr 0.181 3 上述结果表明，实验考察的三种离子液体具有不同的亲疏水性，说明其与蛋白质间的非共价相互作用的强度不同，因此推测其调控蛋白质结晶过程的结果不同，对此需要进一步进行探究。2.2 离子液体对蛋白质晶体形貌的影响 蛋白质分子量越大，聚集倾向越弱，相较小分子的结晶过程就越缓慢，且成功率越低。通过添加剂调控蛋白质分子间的非共价相互作用，是促进蛋白质结晶的一个有效手段。本文研究考察了不同离子液体诱导蛋白质结晶过程。选用溶菌酶作为研究对象，所得晶体的显微镜照片如图 2、图 3、图 4 所示（比例尺 100 m；溶菌酶浓度 10 mg/mL；氯化钠质量分数 4%）。通过显微镜照片可以发现，在实验考察的浓度范围内，溶菌酶可以 注：(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的C2mimBF4浓度分别为 0、0.02、0.1、0.12、0.2、0.3 mol/L。图 2 不同浓度的C2mimBF4诱导下 溶菌酶晶体的显微镜照片 注：(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的C2mim Br 浓度分别为 0、0.06、0.1、0.12、0.2、0.3 mol/L。图 3 不同浓度的C2mimBr 下溶菌酶晶体的显微镜照片 注：(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的C6mim Br 浓度分别为 0、0.06、0.1、0.12、0.2、0.25mol/L。图 4 不同浓度的C6mimBr 下溶菌酶晶体的显微镜照片 顺利结晶，且均呈现四方晶系晶体形貌。但是未加入离子液体时，晶体表面存在明显缺陷，加入三种离子液体后，晶体缺陷改善，晶体表面更加光滑，晶体外观更加规整。此外，与未添加离子液体的结晶过程相比，离子液体调控下的晶体尺寸增大。由图 2、图 3、图 4 可以发现，选用同一种离子液体作为添加剂时，随着离子液体浓度的变化，所得晶体的数量随之变化。当添加剂浓度相同时，三种离子液体诱导下的溶菌酶晶体数量不尽相同。因此，为了明确离子液体对溶菌酶结晶过程的影响，需进一步测定溶菌酶结晶的动力学。2.3 离子液体对溶菌酶结晶动力学的影响 溶菌酶动力学通过测定上清液中溶菌酶浓度随时间的变化规律来表征。溶菌酶浓度通过紫外分光光度计法测定。在 pH 为 4.5 的醋酸-醋酸钠缓冲液中测得的溶菌酶浓度标准曲线如图 5 所示。溶菌酶吸光度数值均在 1 以下，且标准曲线 R2达到 0.999 9，说明标准曲线浓度数据可靠且各点的关联性很好。同时，实112 实 验 技 术 与 管 理 验测定了离子液体的紫外吸收光谱，所研究的离子液体在 280 nm 处不存在吸收，可以认为离子液体对溶菌酶的吸光度没有影响，标准曲线可靠。图 5 溶菌酶吸光度标准曲线 实验测定了不同浓度离子液体存在时，溶菌酶浓度随结晶时间的变化，如图 6 所示。由图可以看出，溶液中溶菌酶的浓度随时间的延长不断下降，且浓度变化趋势不断趋缓，说明随着晶体的析出，溶液中的过饱和度逐渐减小，结晶推动力逐渐减小，结晶过程逐渐减慢。由图 6 可以进一步发现，实验所考察的三种离子液体对溶菌酶的结晶动力学有不同的影响。图6(a)表示加入C2mimBF4后，溶菌酶的结晶动力学曲线。可以发现，当C2mimBF4存在时，溶菌酶浓度的下 降 过 程 比 未 添 加 离 子 液 体 时 要 慢，且 随 着C2mimBF4浓度的升高，结晶速度进一步减慢，即C2mimBF4的加入会减慢溶菌酶的结晶过程。由图6(b)可以看出，加入C2mimBr 后，溶菌酶的浓度变化趋势仅有轻微升高，且对C2mimBr 的浓度不敏感，说明C2mimBr 对于溶菌酶结晶动力学的影响不显著。尽管两种离子液体C2mimBF4和C2mimBr 的CMC 值相近，但对溶菌酶结晶过程的影响趋势却有所不同。根据 Hofmerister 离子序列11，BF4与 Br相比蛋白质沉淀能力弱，但疏水性更强，因此猜测 BF4可能通过疏水相互作用与溶菌酶表面结合，影响了溶菌酶分子的聚集过程，削弱了沉淀剂中的 Cl对溶菌酶表面双电层的挤压，减慢了溶菌酶的结晶过程，从而使其晶体形貌有所改善。加入C2mimBr 后，溶菌酶结晶过程并未出现显著变化，可能是因为溶液中的阳离子C2mim+与溶菌酶存在较弱的非共价相互作用，削弱了溶液中阴离子对溶菌酶沉淀的作用，同样使溶菌酶的晶体形貌有所改善。图 6(c)表示加入C6mimBr 后结晶过程中溶菌酶的浓度变化。与其他两种离子液体相比，C6mimBr对溶菌酶结晶动力学的影响更为显著。C6mimBr 加入后，溶菌酶浓度下降趋势减缓，且随着C6mimBr浓 度 的 升 高，溶 菌 酶 结 晶 速 率 进 一 步 下 降。与C2mimBr 相比，C6mimBr 的 CMC 更低，即C6mim+的疏水性更强。因此，C6mim+可能与溶菌酶有更强的相互作用，进一步减弱了溶液中阴离子对溶菌酶双电层的破坏，降低了溶菌酶分子的聚集趋势，使得结晶速率减慢，从而使晶体形貌更加规整。图 6 不同离子液体加入后溶菌酶的结晶动力学曲线 三种离子液体对溶菌酶结晶动力学的影响呈现C6mimBrC2mimBF4C2mimBr 的趋势，与其疏水性降低的顺序一致。2.4 离子液体与溶菌酶混合溶液的 Zeta 电势 为了验证上述推论，实验测定了含有不同浓度离子液体添加剂的蛋白质溶液的 Zeta 电势。蛋白质颗粒表面的电荷是不同氨基酸残基部分电离的结果，可以通过 Zeta 电势法表征蛋白质颗粒表面的电荷变化情况12，结果如图 7 所示。从图中可以看出，添加C2mimBF4溶液的 Zeta 电势与添加C2mimBr 和C6mimBr 溶液的 Zeta 电势变化趋势不同，说明三种不同的离子液体与蛋白质间的相互作用不同。加入离子液体C2mimBF4后，结晶溶液的 Zeta电势持续下降，说明通过疏水作用使 BF4结合到溶菌酶表面，导致溶液的 Zeta 电势减小。随着C2mimBF4的加入，结合到溶菌酶分子上的 BF4越来越多，结晶溶液的平均 Zeta 电势越来越小，一直到溶菌酶分子上的作用位点全部被 BF4离子占据后，结晶溶液的 Zeta电势才基本稳定不变。与C2mimBF4不同，添加C2mimBr 和C6mimBr 于筱溪，等：基于非共价作用调控蛋白质结晶综合实验设计 113 图 7 不同浓度离子液体与溶菌酶结晶溶液的 Zeta 电势 后，结晶溶液的 Zeta 电势都是随着离子液体浓度的增加先急剧上升，然后开始下降，最终趋于平缓。在离子液体浓度较低时，离子液体解离出来的C2mim+和C6mim+通过疏水作用与溶液中的蛋白质分子发生相互作用，使溶液的平均 Zeta 电势增大。随着离子液体浓 度 的 升 高，结 合 到 溶 菌 酶 分 子 表 面 的 阳 离 子C2mim+和C6mim+浓度逐渐升高。此时，两亲性阳离子C2mim+和C6mim+开始自发组装形成一种“半胶束”的不稳定结构13，溶液的平均 Zeta 电势开始下降。最后，当溶液中C2mim+和C6mim+持续升高达到 CMC 后，C2mim+和C6mim+开始形成胶束。由于C2mim+和C6mim+形成胶束的 Zeta 电势小于溶菌酶电势，溶液的平均 Zeta 电势继续下降。当溶菌酶与离子液体间的相互作用达到饱和后，溶液的平均 Zeta 电势趋于稳定。结合 Zeta 电势的结果与动力学结果可以推测出，实验考察的三种离子液体可以通过疏水相互作用与溶菌酶相结合，影响溶菌酶分子的聚集过程，调控溶菌酶的晶体形貌。3 结语 本实验综合胶体与界面化学、生物物理化学等学科知识，对基于非共价相互作用调控蛋白质结晶这一前沿课题进行了研究。首先利用电导率法测定了离子液体的亲疏水性，在此基础上，探究了离子液体调控溶菌酶的结晶过程，并通过 Zeta 电势探究了离子液体调控蛋白质结晶的作用机制。实验结果表明，将三种不同的离子液体作为添加剂，均可改善溶菌酶的晶体形貌，减少晶体表面缺陷。动力学数据表明，离子液体调控蛋白质结晶的速率按照C6mimBrC2mimBF4C2mimBr 的顺序递增，该顺序与三种离子液体的亲疏水性顺序相对应。对溶液平均 Zeta 电势的分析表明，C6mimBr 和C2mimBr主要通过阳离子与溶菌酶发生疏水相互作用，而C2mimBF4则是通过阴离子与溶菌酶发生疏水相互作用。通过非共价相互作用，离子液体可以调控溶菌酶分子的聚集体，使溶菌酶结晶过程更加稳定，晶体形貌更加规整。通过本实验，学生可以掌握电导率法测定离子液体 CMC 的方法和原理，了解离子液体的电导率随浓度的变化趋势，掌握利用软件处理数据并进行拟合的方法；掌握蛋白质结晶基本原理与操作，熟悉显微镜、紫外分光光度计的使用，了解紫外吸收光谱的分析方法；掌握 Zeta 电势测定方法，以及通过 Zeta 电势解析分子间相互作用的方法；提高团队合作与沟通能力。参考文献(References)1 王淮，杨健康.基于生物信息学分析 F13A1 基因及蛋白质J.医学信息,2020,33(11):5257.2 NANEV C N.Advancements(and challenges)in the study of protein crystal nucleation and growth;thermodynamic and kinetic explanations and comparison with small-molecule crystallizationJ.Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials,2020,66(2):100484.3 QIN W,XIE S X,ZHANG J,et al.An analysis on commercial screening kits and chemical components in biomacromolecular crystallization screeningJ.Crystal Research and Technology,2019,54(9):1900076.4 DONG K,LIU X,DONG H,et al.Multiscale studies on ionic liquidsJ.Chemical Reviews,2017,117(10):66366695.5 EL SEOUD O A,KEPPELER N,MALEK N I,et al.Ionic liquid-based surfactants:Recent advances in their syntheses,solution properties,and applicationsJ.Polymers(Basel),2021,13(7):1100.6 EGOROVA K S,GORDEEV E G,ANANIKOV V 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王其洲，胡从严，叶海旺，等.基于 MatDEM 的锚杆索支护煤巷稳定性数值模拟实验研究J.实验技术与管理，2022,39(7):98103.2 曹耀华，李云婷.深部近距离下位煤层回采巷道围岩变形控制J.煤炭科学技术，2021,49(9):7681.3 丁万奇，马振乾，祖自银，等.基于分形维数的巷道围岩裂隙演化规律研究J.煤田地质与勘探，2021,49(3):167174.4 张康宁，李明.煤层夹矸对巷道围岩稳定性影响研究J/OL.矿业安全与环保,2022,49(1):3441.5 赵增辉，杨鹏，张明忠，等.水环境和非均匀地压联合作用下弱胶结软岩巷道围岩稳定性解析J.采矿与安全工程学报，2022,39(1):126134.6 李季，强旭博，马念杰，等.巷道围岩蝶形塑性区蝶叶方向性形成机制及工程应用J.煤炭学报，2021,46(9):28382852.7 郝登云，崔千里，何杰，等.锚杆锚索支护巷道层状顶板变形特征及离层监测研究J.煤炭学报，2017,42(增刊 1):4350.8 任启刚.南阳坡煤矿综放开采沿空掘巷锚杆（索）支护优化研究J.煤炭科学技术，2018,46(增刊 2):4852.9 孙利辉，张海洋，张小建，等.极软煤层动压巷道围岩大变形特征及全锚索支护技术研究J.采矿与安全工程学报，2021,38(5):937945.10 徐佑林，刘德成，吴旭坤，等.强动压“三软”煤层巷道“卸转固”围岩控制技术J.煤炭科学技术，2021,49(2):3037.11 张德飞，张庆林，张洪伟，等.超深保护层开采巷道围岩控制技术研究J.煤炭科学技术，2021,49(2):4551.12 张宝优.极近距离煤层错层位巷道布置方式及围岩控制技术研究J.煤炭科学技术，2021,49(8):8895.13 杨增强，金珠鹏，刘国栋，等.高应力动压巷道围岩冲击破坏机理与防治技术研究J.矿业安全与环保，2021,48(4):3337.14 张斌，苏学贵，段振雄，等.受掘进扰动影响的巷道围岩稳定性控制研究J.矿业安全与环保，2020,47(6):1924.（编辑：张利芳）（上接第 113 页）8 HARADA L K,PEREIRA J F B,CAMPOS W F,et al.Insights into protein-ionic liquid interactions aiming at macromolecule delivery systemsJ.Journal of the Brazilian Chemical Society,2018(29):19831998.9 ZEHNER B,SCHMIDT F,KORTH W,ET AL.Determination of the critical micelle concentration of imidazolium ionic liquids in aqueous hydrogen peroxideJ.Langmuir,2019,35(49):1629716303.10 BHADANI A,MISONO T,SINGH S,et al.Structural diversity,physicochemical properties and application of imidazolium surfactants:Recent advancesJ.Advances in Colloid and Interface Science,2016(231):3658.11 KANG B,TANG H,ZHAO Z,et al.Hofmeister series:Insights of ion specificity from amphiphilic assembly and interface property J.ACS Omega,2020,5(12):62296239.12 SANTUCCI L,BRUSCHI M,DEL ZOTTO G,et al.Biological surface properties in extracellular vesicles and their effect on cargo proteinsJ.Scientific reports,2019,9(1):13048.13 SEWERYN A.Interactions between surfactants and the skinTheory and practiceJ.Advances in colloid and interface science,2018(256):242255.（编辑：张文杰）