肥胖母鼠对雄性子代生殖力的影响及其机制研究_尹睿.pdf
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1、1 0 9CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 3 月第 35 卷第 2 期收稿日期:2022-08-09;修订日期:2023-02-16基金项目:重庆市自然科学基金重点项目(cstc20220jcyj-zdxmX0011);重庆市科研机构绩效激励引导专项项目(cstc2021jxjl130017);重庆市自然科学基金博士后基金(cstc2020jcyj-bsh0238)作者信息:尹睿,E-mail:。*通信作者,李练兵,E-mail:;卢大儒,E-mail:肥胖母鼠对雄性子代生殖力的影响及其机制研究尹睿1,2,岳小枫2,
2、4,谭小音2,李练兵2,*,卢大儒2,3,*(1西南大学医学研究院生殖医学研究中心,重庆400715;2重庆市人口和计划生育科学技术研究院/国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室,重庆400020;3复旦大学生命科学学院,上海200438;4重庆医科大学附属第三医院泌尿外科,重庆401120)Effects of obese female miceon fertility of male offspringand its mechanismYIN Rui1,2,YUE Xiaofeng2,4,TAN Xiaoyin2,LI Lianbing2,*,LU Daru2,3,*(1.Reprod
3、uctive Medicine Research Center,Medical Research Institute,Southwest University,Chongqing 400715;2.Key Laboratory of BirthDefects and Reproductive Health of National Health Commission,ChongqingPopulation and Family Planning Science and Technology Research Institute,Chongqing 400020;3.School of Life
4、Sciences,Fudan University,Shanghai200438;4.Department of Urology,The Third Affiliated Hospital ofChongqing Medical University,Chongqing 401120,China)【摘要】目的:探讨母体肥胖小鼠对雄性子代生殖能力的影响及其可能机制。方法:以高脂饮食诱导8周建立雌性小鼠肥胖模型,分别与正常饮食雄性小鼠合笼,子鼠出生后分为母体肥胖组和正常对照组,断奶后正常饮食喂至8周,每组随机选取8只雄性子鼠麻醉后处死,分离睾丸和附睾组织,检测精子质量,ELISA法检测睾丸性激素水
5、平,免疫荧光法检测睾丸活性氧(ROS)水平,qPCR和Western blot法分别检测FOXO1、Nrf2基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:与对照组相比,母体肥胖组小鼠精子浓度、精子活力和前向运动精子比率均显著降低(P0.01),精子畸形率显著升高(P0.01)。其他检测结果显示,母体肥胖能引起子代睾丸组织损伤,睾丸内性激素分泌紊乱,睾丸组织ROS水平升高,精原细胞标志物FOXO1表达水平显著上升,氧化应激水平和Nrf2蛋白表达水平均升高(均为P0.01)。结论:在母体肥胖的情况下,子代雄性小鼠睾丸组织存在氧化应激,可能导致精原细胞分化障碍,引起子代生殖损伤。【关键词】母体肥胖;雄性子代;
6、精原细胞;精子发生;叉头转录家族O1中图分类号:R589.2文献标志码:A文章编号:1004-616X(2023)02-0109-07doi:10.3969/j.issn.1004-616x.2023.02.005【ABSTRACT】OBJECTIVE:To investigate effects of obese female mice on reproductive ability of maleoffspring and their possible mechanisms.METHODS:A female mouse obesity model was established byhig
7、h-fat diet induction for 8 weeks,and caged with normal diet male mice.After birth,the offspring weredivided into maternal obesity group and normal control group and fed with normal diet until 8 weeks afterweaning.From each group of mice,8 male offspring were randomly selected and executed after anes
8、thesia.From them,testes and epididymis tissues were isolated,sperm quality was evaluated,testicular sex hormonelevels were detected by ELISA,testes were analyzed using by immunofluorescence Expression levels of mRNAand protein for FOXO1 and Nrf2 genes were detected by qPCR and Western blot,respectiv
9、ely.RESULTS:Compared with the control group,sperm concentrations,sperm motilities and forward motion sperm ratios weresignificantly lower(P0.01)and the sperm malformation rates were significantly higher(P0.01)in the maternalobese mice.Other test results showed that maternal obesity could cause testi
10、cular tissue damage in theoffspring,disturbanceintesticularendocrinehormonesecretion,elevatedtesticulartissueROSlevels,significantly increased expression levels of the spermatogonial marker FOXO1,and elevated oxidative stresslevels and Nrf2 protein expressions(all P0.01).CONCLUSION:Due to maternal o
11、besity,oxidative stresslevels were elevated in testicular tissues of offspring male mice which might have caused impaired theirspermatogonial differentiation and reproductive capacity.【KEY WORDS】maternal obesity;male offspring;spermatogonia;spermatogenesis;FOXO1论著癌变畸变突变1 1 0CARCINOGENESIS,TERATOGENE
12、SIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.2023肥胖症是一种由遗传、环境和生活方式共同引起的代谢性疾病,中国人的肥胖率自 2004 年的 3.1%上升至 2018 年的 8.1%1,育龄妇女肥胖率也急剧上升2-3,肥胖已经成为一项严重的公共健康问题。大量文献研究表明,妊娠期肥胖可改变母体代谢,进而影响母体和胎儿的营养传输,诱发子代罹患神经发育障碍、心血管疾病和II型糖尿病等疾病4-6。但目前关于母体肥胖是否影响雄性子代生殖力的研究较少,因此亟待证明母体肥胖对雄性子代生殖力的影响,并阐释其相关机制,从而进行有效的母婴早期干预,以预防出生缺陷,促进母婴健康。精子的数量和质量是衡量
13、男性生育力的主要标准。精子发生是一个精密复杂的过程,在胚胎早期便出现原始生殖细胞,随后发育成为性原细胞后增殖分化成为A型精原细胞,精原细胞的形成是生精过程的起始,在这个过程中极易受到外界因素的影响,而肥胖可打破精子发生过程中的能量平衡,导致精子发生障碍7。既往研究表明,母体肥胖可影响子代性腺发育,打破睾丸内氧化还原平衡,最终导致睾丸内精原细胞线粒体损伤及细胞凋亡8-10。母体肥胖还可导致子代精子中Peg3基因的启动子DNA 甲基化显著升高,更为严重的是母体肥胖能通过精子tRNA将肥胖表型传递给子代11-12。这些研究表明,母体肥胖可能会影响子代生殖系统,而母体肥胖对子代生精过程的影响尚不清楚。
14、因此,本研究通过建立高脂饮食诱导母体肥胖小鼠模型,观察分析母体肥胖对雄性子代睾丸功能的影响和可能机制,为母体肥胖造成子代生殖力下降提供新的线索。1材料与方法1.1实验动物清洁级6周龄C57BL/6J雌性小鼠30只,购于北京思贝福生物技术有限公司(生产许可证号110324220102752384)。在国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室 SPF 级小鼠饲养室喂养,12 h/12 h 光/暗循环,室温22,湿度30%40%。1.2主要仪器和试剂RNA提取试剂盒,购于南京诺唯赞生物科技公司;BCA蛋白浓度检测试剂盒、GAPDH购于上海碧云天生物技术有限公司;BSA购于美国Sigma 公司;叉头
15、转录家族O1(forkhead box O1,FOXO1)抗体购于武汉Abclonal生物科技公司、Nrf2抗体购于沈阳万类生物技术公司。A48141 VeritiPro PCR 仪购于美国Thermo Fisher公司;Western SDS-Page电泳仪购于美国Bio-rad公司;低温组织匀浆机购于武汉赛维尔生物科技有限公司;藏夹正置显微镜购于日本奥林巴斯公司。1.3饲料成分小鼠饲料购于北京蕙比特科技有限公司(见表1)。高脂饲料作为诱导肥胖母鼠组饮食,低脂饲料作为低脂母鼠组饮食,实验使用的饲料能够保证实验动物的正常生长发育。1.4方法1.4.1肥胖小鼠模型的建立清洁级C57BL/6J雌性
16、6周龄小鼠30只,适应性喂养1周后,分为低脂饮食组与高脂饮食组。低脂饲料喂食的8只小鼠为基础对照组(n=8),高脂饮食诱导8周后,将体质量超过基础对照组25%的小鼠归为肥胖组(n=10)。两组雌鼠喂养8周后分别将其与正常雄鼠交配。母体肥胖的子代定义为母体肥胖组,选取不同母体子鼠共8只(n=8);低脂母体定义为对照组,选取不同母体子鼠共8只(n=8)。保持小鼠自由饮食与饮水,每日定时换水换食,记录每周每只鼠的进食量,定期称量小鼠。1.4.2肥胖雌鼠血糖检测在高脂诱导至第8周时将小鼠禁食12 h后,取尾末梢血进行糖耐量检测。使用强生血糖检测仪记录空腹时血糖,再按照1.5 mg/g腹腔注射20%葡萄
17、糖溶液,于注射后15、30、60和120min时分别记录血糖值。1.4.3精子质量检测子鼠出生8周后,随机挑选8只雄性小鼠,按照1 mL/kg剂量对子鼠腹腔注射5%戊巴比妥,麻醉后眼球取血后快速断颈处死,取出睾丸放入液氮速冻与4%多聚甲醛保存,取出附睾将其放入37 预热好的PBS中充分剪碎,在37 金属浴中恒温孵育30 min,充分游离精子,过滤,留取滤液,表1小鼠饲料组成成分/(g/kg)成分酪蛋白玉米淀粉麦芽糖糊精蔗糖纤维素大豆油猪油矿物油矿物质磷酸氢钙碳酸钙柠檬酸钾维生素混合物酒石酸氢胆碱FD&C蓝色色素#5FD&C蓝色色素#5低脂饲料(10%脂肪)2003506.212568.8502
18、52010135.516.51020.010.04高脂饲料(60%脂肪)2003012568.8502524510135.516.51020.050论著癌变畸变突变1 1 1CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 3 月第 35 卷第 2 期取10 L样本制片,在显微镜下分别观察记录样片中的精子数量、前向运动和原地运动及不动精子数量,完成初步统计。取10 L精液样本涂片后无水乙醇固定,进行下一步精子形态HE染色后对畸形精子计数。1.4.4免疫组化染色将睾丸组织石蜡切片烘烤2 h后,二甲苯脱蜡20 min,乙醇梯度脱蜡(乙醇浓度依次为100%
19、、100%、95%、90%、80%、70%),柠檬酸钠抗原修复液95 修复15 min后自然冷却,使用3%甲醇-H2O2去除内源性过氧化物酶,然后用山羊血清封闭30 min,滴加兔来源的FOXO1一抗(1100稀释)在湿盒中4 孵育过夜。PBS清洗后滴加二抗。DBA显色剂显色后快速苏木素染色,梯度乙醇脱水(乙醇浓度依次为70%、80%、90%、95%、100%、100%),二甲苯透明,烘干,中性树胶封片后显微镜下观察、拍照。用ImageJ软件分析染色单位面积百分比。1.4.5睾丸组织活性氧检测取出睾丸组织后立即放入液氮中保存,随后将睾丸组织进行冰冻切片,室温下复温,控干水分,用组化笔在组织周围
20、画圈(防止抗体流走),在圈内加入自发荧光淬灭剂5 min,流水冲洗 10min。在 圈 内 滴 加 活 性 氧(reactiveoxygenspecies,ROS)染液,避光恒温箱 37 孵育 30 min。随后把玻片置于PBS(pH=7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10 min。再把玻片置于PBS(pH=7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像(DAPI紫外激发波长330380 nm,发射波长 420 nm,发蓝光;FITC 激发波长 46549
21、5nm,发射波长515555 nm,发绿光;CY3激发波长510560 nm,发射波长590 nm,发红光)。DAPI染色的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为红光。1.4.6实时荧光定量PCR检测睾丸组织中FOXO1mRNA表达水平使用mRNA提取试剂盒将冰冻睾丸组织在-10 中匀浆,12 000 g离心取上清液后根据mRNA快速提取试剂盒说明书提取组织mRNA。使用紫外分光光度计检测各组RNA浓度,根据反转录试剂盒将总RNA反转录合成cDNA。95 预变性30 s后开始 PCR 循环:95 预变性 5 s,95、1 min,60、30 s,共循环 40 次;熔解曲线:72 延伸10 mi
22、n。以 GAPDH 为 内 参,采 用2-CT法 计 算FOXO1 mRNA表达水平。引物均为上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列:GAPDH,正向5-GCGAGATCCCGCTAACATCA-3,反向 5-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3;FOXO1,正向 5-CCAGCTGAAACCACAGAGAA-3,反向 5-ACAGTTCCCCAAAGGTGTTC-3。1.4.7Western blot 检测FOXO1、Nrf2蛋白的表达将睾丸组织放置在400 L含有5%蛋白酶抑制剂的RIPA组织裂解液中,在赛维尔组织研磨机中-10 匀浆,在 4 低温离心机 12 000 g 离心
23、 5 min 后取上清,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后,配置成体系。蛋白质通过SDS-PAGE分离,转移至PVDF膜后用快速封闭液封闭 15 min,分别加入抗 FOXO1、Nrf2、GAPDH 抗体(均按 11 000 稀释)4 孵育过夜,TBST清洗后用HRP标记的二抗孵育2 h,化学发光后用ImageJ软件统计分析每组蛋白的相对表达水平。1.5数据统计采用GraPhPad Prism 8统计软件对母体肥胖组和对照组各指标间的差异采用单因素方差分析,实验数据均以平均值标准差表示,P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1成功构建小鼠肥胖模型自第2周开始高脂饮食组与低脂饮食组体质量出现
24、明显差异(P0.05);第8周时,高脂饮食组小鼠的平均体质量显著超过低脂饮食组体质量25%,共有10只模型小鼠达到肥胖定义标准(图1A)。对肥胖母鼠进行尾部静脉血糖检测,在空腹时高脂饮食组与低脂饮食组无显著差异;注射20%葡萄糖15和30 min后,高脂饮食组血糖值显著高于低脂饮食组(P0.01),到注射后 60 和 120 min 时两组间血糖值无显著差异(图1B)。以上结果表明雌性肥胖小鼠建模成功,并且肥胖可导致模型鼠糖代谢紊乱。2.2母体肥胖引起雄性子鼠体质量变化在雄性子代哺乳期前两周,母体肥胖组小鼠的体质量相较于对照显著升高;第3周时两组的体质量差异无统计学意义;哺乳期后,给予两组子代
25、鼠基础饲料喂养至8周,在第6周母体肥胖组体质量相对于对照组明显增加,在第8周时两组子鼠体质量差异无统计学意义(见表2)。与对照组比较,*P0.05,*P0.01.周龄12368对照组/g3.390.265.340.419.690.4019.630.7722.680.72母体肥胖组/g4.120.24*6.070.36*10.270.5320.230.77*23.121.53表2两组子代雄鼠体质量变化比较论著癌变畸变突变1 1 2CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.20232.3母体肥胖引起子代雄性小鼠精液质量下降小鼠精液质
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