鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重PCR检测方法的建立_林而舒.pdf
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1、林而舒,卓玉琛,陈斌,等.鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重 PCR 检测方法的建立J.福建农业学报,2022,37(11):13941399.LIN E S,ZHUO Y C,CHEN B,et al.Establishment and application of duplex PCR detection system between Anguillid herpesvirus and EelcircovirusJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences,2022,37(11):13941399.鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重 PCR检测方法的建立林而舒
2、,卓玉琛,陈斌,林煜,钟全福,樊海平,曾占壮(福建省淡水水产研究所,福建福州350002)摘要:【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AHV)与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的双重 PCR 法。【方法】优选 PCR 引物组合,建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重 PCR 检测方法,探究双重 PCR 扩增条件,并检验该方法的特异性、灵敏性和临床样品检测效果。【结果】双重 PCR 法同时扩增出鳗鲡疱疹病毒 690bp 和鳗鲡圆环病毒 338bp 特异性片段,与猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duckc
3、ircovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)的核酸不发生扩增反应。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒重组质粒标准品的最低全检出量为 5.010-4gmL-1。用所建立的双重 PCR 方法对 50 份临床病鳗进行检验,其中鳗鲡疱疹病毒的感染率为 16%,鳗鲡圆环病毒的感染率为 68%,共感染率为 8%。该感染率与单一 PCR 检测结果完全一致。【结论】建立的鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒双重 PCR 检测法不仅特异性强、灵敏度高、重复性好,而且临床应用效果佳,为鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的快速检测提供了有效的技术支持。关键词:鳗
4、鲡疱疹病毒;鳗鲡圆环病毒;双重 PCR;检测方法中图分类号:S941文献标志码:A文章编号:1008-0384(2022)11139406Establishment and application of duplex PCR detection system between Anguillidherpesvirus and Eel circovirusLINErshu,ZHUOYuchen,CHENBin,LINYu,ZHONGQuanfu,FANHaiping,ZENGZhanzhuang(Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian P
5、rovince,Fuzhou,Fujian350002,China)Abstract:【Objective】TheaimofthepresentstudywastoestablishaduplexPCRmethodfordetectionofAnguillidherpesvirusandEel circovirus.【Method】RoutinePCRprimerswerepreferredtooptimizetheamplificationconditionsandtestthespecificityandsensitivityofthemethod.Atthesametime,thesic
6、keelofsuspectedcasescollectedfromdifferentfarmweredetectedbytheduplexPCRmethod,andcomparedwiththeroutinePCRmethod.【Result】Theresultsshowedthatthespecificfragmentsof690bpand388bpwereamplifiedbyusingtheduplexPCRfromDNAsamplesofAnguillid herpesvirusand Eel circovirus,respectively.But the nucleic acid a
7、mplification results of Porcine circovirus,Duck circovirus,Koiherpesvirusand Cyprinid herpesviruswerenegative.WhenthepositiveDNAconcentrationsofbothAnguillid herpesvirusandEel circovirus were diluted to 5.010-4 gmL-1,the corresponding target fragments could still be detected.50 samplescollectedfroms
8、uspectedcasesofsickeelswerediagnosedbyPCR.TheinfectionrateofAnguillid herpesviruswas16%.Theinfection rate of Eel circovirus was 68%.The infection rate of Anguillid herpesvirus andEel circovirus was 8%.【Conclusion】TheresultsindicatethattheduplexPCRdetectionmethodhascertainspecificityandsensitivity,an
9、dcanbeused for the detection and differential diagnosis of recessive cases of clinical infection of Anguillid herpesvirus and EelcircovirusKey words:Anguillid herpesvirus;Eel circovirus;duplexPCR;testmethod收稿日期:20220810初稿;20221105修改稿作者简介:林而舒(1993),女,硕士,助理农艺师,研究方向:水产病害(E-mail:)基金项目:福建省科技计划公益类专项(2022R
10、11010014-5、2023R11010017-4)福建农业学报2022,37(11):13941399http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.0040引言【研 究 意 义】鳗 鲡 疱 疹 病 毒(Anguillidherpesvirus,AHV)是线性双链 DNA 病毒,基因组全长 248kb,含 136 个开放阅读框1。AHV 毒株的首次分离是由 Sano 等从日本鳗鲡(Anguilla japonica)体内分离得到的2。鳗鲡疱疹病毒病鳗常呈现“脱黏”“红头”
11、“败血”等临床症状3。鳗鲡圆环病毒(Eelcircovirus,EeCV)是小型的环状单链 DNA 病毒,包含两个主要的开放阅读框,以相反的方向排列,编码复制启动蛋白和衣壳蛋白。其临床症状主要表现为头部发红、鱼体腹部出血点、鳃部溃烂、部分病鱼喉部囊肿增生物,与鳗鲡疱疹病毒临床症状非常相似46。随着国内鳗鲡行业的不断发展,鳗鲡养殖过程中出现的相关疾病越发得到重视7。鳗鲡疱疹病毒病和鳗鲡圆环病毒病在鳗鲡养殖过程中发生日趋频繁,由于两者的临床症状有许多相似之处,且常混合感染,难以肉眼进行区分1,4。因此亟需建立一种快速、简便且能够同时检测这两种常见鳗鲡病毒性疾病的检测方法,为其流行病学调查及防控提供
12、技术基础。【前人研究进展】目前已报道的 AHV 和EeCV 的检测方法包括免疫过氧化物酶单层实验法、免疫间接荧光抗体实验法、原位杂交法和荧光定量PCR 法。这些方法都存在一定的局限性,如需要特定抗体、抗体获取难度较大、所需仪器价格昂贵、操作复杂和对操作人员身体有害等1,810。双重PCR 检测方法能够在同一 PCR 反应管中同时检测两种病毒,操作简单,检测时间和检测成本得以大大降低,且双重 PCR 检测方法具有特异性强和敏感性高等优点1113。该方法在动物疫病检测领域已经广泛应用,如苗艳等14于 2022 年建立了鸽疱疹病毒和鸽痘病毒双重 PCR 检测方法;徐通等15于 2021年建立了猪圆环
13、病毒型和型双重 PCR 检测方法。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒已经分别建立了普通 PCR 检测法和荧光定量 PCR 法1,4,16。【本研究切入点】但是关于两者同时检测的双重 PCR 检测方法还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究筛选组合引物对,优化反应体系及反应条件,建立同时检测鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的双重 PCR 方法,为这两种鳗鲡病毒性疾病的诊断、流行病学调查及病害防控提供技术支持。1材料与方法1.1病鳗与病毒20212022 年期间,于福建省大田、邵武、福清和江西武宁、吉安等地区的鳗鲡养殖场采集具有红头、脱黏、烂鳃后“开窗”、喉部囊肿等临床症状的疑似鳗鲡病样。猪圆环病毒(Porcin
14、e circovirus)DNA 由福建农林 大 学 动 物 科 学 学 院 馈 赠;鸭 圆 环 病 毒(Duckcircovirus)DNA 由福建省农业科学院馈赠;锦鲤疱疹 病 毒(Koi herpesvirus)DNA 和 鲤 疱 疹 病 毒(Cyprinid herpesvirus)DNA 由中国水产科学研究院长江水产研究所馈赠。1.2主要试剂海洋动物基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科 技(北 京)有 限 公 司;PremixTaqTM(ExTaqTMVersion2.0plusdye)试剂盒和质粒抽提试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司;T 载体 PCR 产物快速连接试剂盒
15、、DNAMarker、DiaSpin 柱式 DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.3引物合成试验所用引物均由上海生物工程(生工)有限公司合成,用于扩增鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的特异性序列(表 1)。表 1 引物列表Table 1 Primer list引物名称Primername引物序列(5-3)Primersequences(5-3)目的片段大小Primersize/bp参考文献ReferenceAHV-49FGGATCCATGATTTGTTGGGCGG6901AHV-49RGAATTCTCATACGCAGCTCCCAAGEeCV-FACGACCAGCATAACAAG
16、GA3884EeCV-RAACCAGCCGTAGAAATCAT1.4制备模板 DNA将患病鳗鲡的皮肤黏液、鳃部和肝脏等重要组织剪碎混合,后使用海洋动物基因组 DNA 提取试剂盒提取病毒总 DNA,放置于20 保存备用。第11期林而舒等:鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重 PCR 检测方法的建立13951.5制备阳性重组质粒以含 AHV 和 EeCV 的 DNA 为模板进行 PCR,反应体系如下(20L):模板 DNA2L,2PCRMix10 L,ddH2O 4 L,AHV 上 游、下 游 引 物(10mol.L-1)和 EeCV 上游、下游引物(10mol.L-1)各1.0L。反应条件:94 预变
17、性 5min;94 变性30s,55 退火 30s,72 延伸1min,循环 30 次;72 延伸 10min。扩增产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小,再使用胶回收试剂盒回收条带大小正确的 PCR 产物。将 T 载体与回收的 PCR 产物连接,并转化至 DH5 感受态细胞中,过夜培养。挑选并PCR 鉴定单菌落,然后将初步鉴定准确的阳性重组质粒 T-AHV 和 T-EeCV 送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,然后与 NCBI 上的序列进行比对,最后将测序结果正确的阳性重组质粒置于20 保存备用。1.6PCR 反应条件优化探究退火温度和引物浓度对所建立的双重 PCR检测方法的影响。以
18、 AHV 和 EeCV 的阳性重组质粒为模板,反应体系同 1.5,退火温度选择 5060的 8 个温度(分别为 60、59.3、58.1、56.3、54、52.3、50.9 和 50)进行优化。引物浓度选择 4、6、8、10 和 12molL1进行优化。1.7特异性检测用所建立的 AHV 和 EeCV 双重 PCR 检测方法对猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duckcircovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)的 DNA 模板进行PCR 扩增,以检测其特异性。1.8敏感性检测将 AH
19、V 和 EeCV 阳性重组质粒用 ddH2O 调节为相同浓度,并等量进行混合。该混合物作为双重PCR 的阳性标准质粒,其初始质量浓度为50gmL1。10倍倍比稀释至 5.0105.0107gmL1作为敏感性检测,ddH2O 为阴性对照。1.9重复性检测选取 4 份 AHV 和 EeCV 混合感染的病料 DNA,通过建立的双重 PCR 检测方法进行扩增,并重复 3次,以检测该方法的重复性。1.10临床样品的检测利用双重 PCR 检测方法,对实验室保存的 50 份采自福建省大田、邵武、福清和江西武宁、吉安等地区的病料进行检测,并将双重 PCR 结果与单一PCR 检测结果进行比较,评价该方法的临床实
20、用性。2结果与分析2.1AHV 和 EeCV 阳性质粒构建结果如图 1 所示,AHV 和 EeCV 特异性扩增的目的片段分别为 690bp 和 388bp,与预期扩增大小一致。将扩增产物分别与 T 载体连接后构建 T-AHV和 T-EeCV 重组质粒,将重组质粒进行测序比对后,发现测序结果与参考序列之间的同源性为 99%以上,表明 AHV 和 EeCV 的 T 载体阳性重组已经成功构建。2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp 1 M 2 3 M 4690 bp388 bp1:阴性对照;2:AHV;3:EeCV;4:阴性对照;M:DL-2000Marke
21、r。1:Negative control;2:AHV;3:EeCV;4:Negative control;M:DL-2000Marker.图 1 单一 PCR 扩增结果Fig.1 Routine PCR amplification results2.2双重 PCR 退火温度和引物浓度优化结果如图 2 和图 3 所示,8 个退火温度(60、59.3、58.1、56.3、54、52.3、50.9和 50)中仅有 50 无法扩增出 AHV 和 EeCV 的目的条带,其他温度均有较好的扩增效果。而当引物浓度分别为 4、6、8、10 和 12molL1时,均扩增出 AHV 和 EeCV 的目的条带,由此
22、可见该组合的引物扩增性较强。1 M 2 3 4 5 6 7 8 92 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp690 bp388 bp1:阴性对照;29 表示温度为 50、50.9、52.3、54、56.3、58.1、59.3、60;M:DL-2000Marker。1:Negativecontrol;29:50,50.9,52.3,54,56.3,58.1,59.3,60;M:DL-2000Marker.图 2 双重 PCR 退火温度优化Fig.2 Duplex PCR annealing temperature optimization1396福建农业学报
23、第37卷2.3双重 PCR 特异性检测结果如图 4 所示,建立的 AHV 和 EeCV 双重 PCR方法对猪圆环病毒、鸭圆环病毒、鲤疱疹病毒和锦鲤疱疹病毒的阳性样品均无扩增,表明所建立的AHV 和 EeCV 双重 PCR 检测方法的特异性较高。1 2 3 4 M 52 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp1:猪圆环病毒;2:鸭圆环病毒;3:鲤疱疹病毒;4:锦鲤疱疹病毒;5:阴性对照;M:DL-2000Marker。1:Porcine circovirus;2:Duck circovirus;3:Cyprinid herpesvirus;4:Koiherp
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