车前草提取物对缺氧性肺动脉高压大鼠模型氧化应激的影响_邓堂.pdf
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1、现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.01.008车前草提取物对缺氧性肺动脉高压大鼠模型氧化应激的影响*邓堂1,2钟士杰1,2刘华江2张名林2魏胜超2廖勇2史键山2金桂云1,2吕鹏飞3(1 海南医学院第一附属医院介入血管外科 海南 海口 570000;2 海南医学院急救与创伤研究教育部重点实验室 海南 海口 570000;3 海南医学院第一附属医院乳腺外科 海南 海口 570000)摘要 目的:研究车前草提取物(PW)的抗氧化性对缺氧性肺动脉高压(HPH)大鼠模型氧化应
2、激的影响,分析并测定 PW 中发挥抗氧化的主要成分。方法:随机选取 18 只 SD 雄性大鼠分为 3 组:CONT 组、HPH 组、HPH+PW 组。CONT 组和 HPH 组予生理盐水灌胃,HPH+PW 组予车前草提取物灌胃,连续灌胃 4 周,测定大鼠肺动脉压力(mPAP),肺功能相关指标(0.4 sFEV、FVC、0.4sFEV/FVC、MMEF)后处死。试剂盒测定各组大鼠肺泡灌洗液中 SOD、CAT、LDH、MDA 含量。液相色谱-质谱分析鉴定 PW 中的有效成分并测定 PW 有效成分对超氧阴离子的清除能力。结果:HPH 组与 PW 组相比,mPAP 显著升高(*P0.01),0.4 s
3、FEV、FVC、0.4sFEV/FVC、MMEF 显著降低(*P0.01),HPH+PW 可逆转上述趋势。HPH 组与 Cont 组相比,SOD、CAT 显著降低(*P0.01),LDH、MDA 显著升高(*P0.01),HPH+PW 可逆转上述趋势。液相色谱-质谱分析并鉴定出 PW 中含有车前子苷、高车前苷、-谷甾醇、齐墩果酸、熊果酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、葡萄糖 8 种有效成分,其中桃叶珊瑚苷的超氧阴离子清除能力最强。结论:PW 可提高 HPH 大鼠抗氧化酶含量,减轻氧化应激反应并降低肺动脉压力,改善肺功能;PW 有效成分中桃叶珊瑚苷(AU)的抗氧化能力最强。关键词:车前草提取物;缺氧性
4、肺动脉高压;抗氧化;氧化应激中图分类号:R-33;R544.16;R243文献标识码:A文章编号:1673-6273(2023)01-41-06Effect of Plantago Depressa Willd Extract on Oxidative Stressin a Rat Model of Hypoxic Pulmonary Hypertension*DENG Tang1,2,ZHONG Shi-jie1,2,LIU Hua-jiang2,ZHANG Ming-lin2,WEI Sheng-chao2,LIAO Yong2,SHI Jian-shan2,JIN Gui-yun1,2,
5、L Peng-fei3(1 Department of Interventional Radiology and Vascular Surgery,The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou,Hainan,570000,China;2 Key Laboratory of Emergency and Trauma of Hainan Medical University,Ministry of Education,Haikou,Hainan,570000,China;3 Department of Breas
6、t surgery,The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou,Hainan,570000,China)ABSTRACT Objective:To study the effect of antioxidant properties of plantain extract(PW)on oxidative stress in a rat model ofhypoxic pulmonaryhypertension(HPH),and to analyze and determine the main compon
7、ents of PW that exert antioxidant effects.Methods:Eighteen SD male rats were randomly selected and divided into three groups:the CONT group,the HPH group,and the HPH+PW group.the CONT and HPH groups were gavaged with saline,and the HPH+PW group was gavaged with PW for 4 weeks.MPAP,pulmonaryfunction-
8、related indexes(0.4 sFEV,FVC,0.4 sFEV/FVC,and MMEF)were measured in rats after gavage.MMEF)and then executed.The kits were used to determine the contents of SOD,CAT,LDH and MDA in the alveolar lavage fluid of rats in each group.Liquidchromatography-mass spectrometry(LC-MS)analysis was performed to i
9、dentify the active ingredients in PW and to determine the scav-enging ability of PW active ingredients on superoxide anion.Results:In the HPH group,mPAP was significantly higher(*P0.01)and0.4 sFEV,FVC,0.4 sFEV/FVC,and MMEF were significantly lower(*P0.01)compared with the PW group,and HPH+PW reverse
10、dthese trends.mPAP was significantly lower(*P0.01)and LDH and MDA were significantly higher(*P0.01)compared with the Contgroup.(*P0.01),and HPH+PW could reverse the above trend.Liquid chromatography-mass spectrometry analysis and identification ofPW contained eight active ingredients of psyllium,hyp
11、ericin,-sitosterol,oleanolic acid,ursolic acid,kynurenine,peach leaf coral gluco-side,glucose,of which peach leaf coral glucoside had the strongest superoxide anion scavenging ability.Conclusion:PW can increase thecontent of antioxidant enzymes in HPH rats,reduce oxidative stress,reduce pulmonary ar
12、tery pressure,and improve pulmonary function.Aucubin(AU)has the strongest antioxidant capacity among the active components of PW.Key words:Extract of Plantago depressa Willd;Hypoxic pulmonary hypertension;Antioxidant;Oxidative stressChinese Library Classification(CLC):R-33;R544.16;R243Document code:
13、AArticle ID:1673-6273(2023)01-41-06*基金项目:海南省重点研发社会发展项目(ZDYF2022SHFZ293;国家自然科学基金项目(31560267);海南省自然科学基金(820RC764)作者简介:邓堂(1986-),男,硕士,主要研究方向:外周血管疾病,E-mail:通讯作者:金桂云,E-mail:;吕鹏飞,E-mail:(收稿日期:2022-05-27 接受日期:2022-06-23)41现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023前言缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary
14、 hypertension,HPH)是一种以活动后呼吸困难及乏力为主要表现的临床综合征1,2。全球范围有关 HPH 的流行病学调查很少,但该病临床常见,慢性阻塞性肺疾病(COPD)、限制性肺疾病等均可引起HPH,其中 COPD 是 HPH 最常见的病因,伴发 HPH 的患病率约为 20%-91%3。在长期低氧刺激下,体内氧化/抗氧化平衡失调,过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶生成减少,乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)等氧化应激指标升高,肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡通路抑制,血管平滑肌层增厚,肺动脉狭窄重塑,肺动脉压力升高,肺功能降低,最终导致 HPH4-6。
15、目前 HPH 患者生存期有限,临床上暂无有效治愈手段,针对该病 FDA(美国食品和药物管理局)无批准药物治疗方法,HPH 也因此被认为是大血管领域的 癌症。中国肺动脉高压诊断与治疗指南(2021 版)将长期氧疗作为 HPH 首要推荐方案3,但长期氧疗耗时长,许多患者难以耐受,且氧疗只能改善部分肺泡缺氧,对肺动脉压力降低有限。如何提高HPH 患者抗氧化能力,逆转肺动脉重塑,降低肺动脉压力,改善肺功能,仍是一个亟待解决的问题。车前草(Plantago depressaWilld,PW)别名车茶草,蛤蟆叶,喜温热潮湿的环境而盛产于沿海地带,是一种药用价值高,全草均可入药的野生中草药7,具有抗氧化、抗
16、炎、抗菌、提高免疫力、抗肿瘤等作用8-11;PW 内含车前子苷、高车前苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷等多种化学成分12,13。在本研究中,我们使用 PW 干预 HPH 大鼠模型,发现 PW 能提升 HPH 大鼠抗氧化能力,降低氧化应激指标,对PW 提取物进一步分析鉴定显示,桃叶珊瑚苷(Aucubin,AU)抗氧化功效最强。1 资料与方法1.1 实验动物随机选取 SD 雄性大鼠(SPF 级)18 只,重量(16010)g,周龄 67 周,动物来源公司:湖南天勤公司,饲养环境:海南医学院动物实验室,实验已经海南医学院动物伦理委员会认证批准。1.2 实验试剂野生车前草粗略提取物,超氧阴离子清除能力试剂盒
17、(碧云天公司),CAT、SOD、LDH、MDA 试剂盒(南京建成公司)。1.3 车前草提取物制备车前草采摘自海南省儋州市,称取 1 g 样本用液氮研磨后转移到 50 mL 三角瓶中,加入 10 mL 乙醇,于室温、200 W 条件下超声提取 30 min(间隔 5 min 振摇一次),12000 r/min 转速下离心 10 min,取上清液,待测。按照上述方法,称取 5 g 样本,加入 50mL乙醇,超声提取 30min 后,离心后取上清液得到 40mL。重复操作 10 次(即 50 g 样本),制得 400 mL 上清液,4冷藏备用14。1.4 实验方法1.4.1 造模与分组选取 1601
18、0 g 的 SD 雄性大鼠 18 只,置于常压低氧舱造模,维持舱内氧浓度在 10%左右,并保证分布均匀,用无水氯化钙和钠石灰吸收低氧舱内的水蒸气与二氧化碳,维持舱内温度恒定在 22-24,昼夜比为 1:1,缺氧 12 h/天,连续低氧条件饲养 4 周。4 周后经右颈静脉置管使用 Med-Lab-U 生物信号采集处理系统测定各组大鼠肺动脉压力(mPAP)。随机筛选出 mPAP25 mmHg 的 12 只大鼠作为HPH 组及 HPH+PW 组。大鼠分为 3 组,对照组(Cont 组)、缺氧性肺动脉高压(HPH组)、车前草干预组(HPH+PW 组),每组各 6 只。随机选取 6 只健康大鼠作为 Co
19、nt 组,Cont 组及 HPH 组均用生理盐水(NS)灌胃,HPH+PW 组根据大鼠公斤体重按浓度 0.125 g/mL,8 g/kg的 PW 灌胃,4 周后进行相关指标检测。1.4.2 肺功能测定本实验使用的肺功能检测系统购自上海塔望科技公司,大鼠禁食水 1 天,检测前腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉各组大鼠,经皮气管切开插管,固定气管插管,连接仪器,予 FEV 模式检测 0.4 sFEV(第 0.4 秒用力呼气容积)、FVC(用力肺活量)、0.4sFEV/FVC、MMEF(最大呼气中段流速)。1.4.3 肺动脉压力检测本实验使用的肺动脉压力检测系统(MedLab-U 采集系统)
20、购自南京美易科技公司,检测前经皮切开暴露右侧颈静脉,穿刺插管,连接压力测定导管及仪器,对肺动脉压力动态曲线图进行记录,数据分析,每次测定选取 5 个连续波谷的平均值16。1.4.4 肺泡灌洗液中抗氧化酶(CAT、SOD)及氧化应激指标(MDA、LDH)含量测定取 3 mL 无菌 NS 反复灌洗主支气管3次,收集于无菌管中,离心后收集上清,按照过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)检测试剂盒说明书操作,测定各样品孔 OD 值,根据吸光度值统计出肺泡灌洗液中 CAT、SOD、MDA、LDH 的实际含量。1.4.5 车前草提取物有效成分鉴定分析将车前子
21、苷、高车前苷、-谷甾醇、齐墩果酸、熊果酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、葡萄糖标准品分别用乙醇配置成 1 g/mL 的标准溶液进样10 L 检测;葡萄糖使用超纯水配置成 1 g/mL 的标准溶液进样 10 L 检测。检测所用的仪器为岛津超高效液相色谱仪(LC-30)连接 SCIEX 5600+质谱仪,设定好参数及色谱-质谱条件,进样检测。1.4.6 车前草提取物有效成分抗氧化能力检测称取约 50mg样品于研钵中,进行液氮研磨,研磨后转入 2 mL 离心管中,加入 1 mL 80%乙醇,于 50 200W 条件下超声振荡 30 min(间隔5 min 振荡混匀一次),室温下 12000 rpm,离心
22、10 min,取上清待测;用 80%乙醇稀释各标准品至 1 mg/mL 待测;可见分光光度计预热 30 min 并调至 570 nm,蒸馏水调零,所有试剂至室温(25);在 EP 管中依次加入样本混匀,于 37反应10 min,使用超氧阴离子清除能力试剂盒检测,于波长 570 nm下测定吸光值 A。根据计算公式:超氧阴离子清除率 I%=1-(A 测定-A 对照)A 空白100%,计算出 PW 内有效成分的超氧阴离子清除率15。1.5 统计学方法应用 SPSS 24.0 软件对肺动脉压力、肺功能、肺泡灌洗液中抗氧化酶及氧化应激指标进行统计分析,并表示为均值标准差。Cont 组与 HPH 组、PW
23、 组与 HPH 组之间成对比较,采用两独立样本均数 T 检验。若 P0.05 则认为差异有统计学意义,P0.01 差异有显著性。42现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.20232 结果2.1 各组大鼠日常表现HPH 组大鼠反应较迟钝,虚弱无力,体毛稀疏,蜷缩少动,精神倦怠,食量和体重下降;Cont 组大鼠反应灵活,体毛浓密,食量和体重正常;PW 组大鼠的反应、精神、体毛、食量和体重均处于 Cont 组和 HPH 组之间。2.2 肺功能、肺动脉压力检测与 Cont 组 比,HPH 组 0.4sFEV、FVC、0.4sFEV/F
24、VC、MMEF 均显著降低(*P0.01);与 HPH 组比,HPH+PW 组上述指标均显著增高(#P0.01)。与 Cont 组比,HPH 组 mPAP 显著增高(*P0.01);与 HPH 组比,HPH+PW 组 mPAP 显著降低(#P0.01)。图 1 1A-1D 为气管插管检测各组大鼠肺功能指标(0.4sFEV、FVC、0.4sFEV/FVC、MMEF);1E 为右心导管检测各组大鼠肺动脉平均压(mPAP);Fig.1 1A-1D are the pulmonary function indexes(0.4sFEV,FVC,0.4sFEV/FVC,MMEF)detected by e
25、ndotracheal intubation;1E is the mean pulmonaryartery pressure(mPAP)detected by right heart catheterization;Note:N=6,xs,*means compared with Cont group,*P0.05,*P0.01,#means compared with HPH group,#P0.05,#P0.01.2.3 肺泡灌洗液中抗氧化酶(SOD、CAT)及氧化应激指标(LDH、MDA)含量测定与 Cont 组比,HPH 组大鼠 SOD、CAT 显著降低(*P0.01),LDH、MDA
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