常压室温等离子体诱变与微生...滴培养选育谷胱甘肽高产菌株_凌思雨.pdf
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1、200 2023,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养 选育谷胱甘肽高产菌株凌思雨,王 洲,张会敏,李 闯,刘庆涛,刘 艳,薛正莲*(安徽工程大学生物与食品工程学院,安徽省工业微生物分子育种工程实验室,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽 芜湖 241000)摘 要:为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑
2、作为筛选因子,利用微生物微液滴培养(microbial microdroplet culture system,MMC)仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1 株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明:出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达(312.132.62)mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7 次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高
3、效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。关键词:谷胱甘肽;毕赤酵母;常压室温等离子体诱变;适应性进化;菌种筛选Breeding of a High-Yield Glutathione-Producing Strain by Atmospheric and Room Temperature Plasma Mutagenesis and Microbial Microdroplet Culture SystemLING Siyu,WANG Zhou,ZHANG Huimin,LI Chuang,LIU Qingtao,LIU Yan,XUE Zhen
4、glian*(Anhui Engineering Laboratory for Industrial Microbiology Molecular Breeding,Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation,College of Biology and Food Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)Abstract:In order to improve the ability of a wild-type str
5、ain(BY-1)of Pichia pastoristoproduceglutathione(GSH),amutantstraindesignatedBY-1-26wasobtainedbyatmosphericandroomtemperatureplasma(ARTP)mutagenesis.Tofurtherimprovetheproductionofglutathionebythemutantduringshakeflaskculture,1,2,4-triazolewasaddedtotheculture medium.Finally,adaptive evolution of th
6、e mutant strain was carried out on a microbial microdroplet culture system(MMC)using1,2,4-triazoleasascreeningfactor.Asaresult,ahigh-yieldglutathione-producingmutantstrainBY-2-24wasobtained,anditsgeneticstabilitywasinvestigated.Theresultsshowedthatahigh-yieldglutathione-producingmutantstraincouldbeo
7、btainedusingthewild-typestrainBY-1byARTPmutagenesis,primaryresistancescreeningongradientplates,adaptiveevolutiononMMCandshake-flasksecondaryscreening.TheyieldofglutathioneproducedbyBY-2-24inshakeflaskculturewas(312.132.62)mg/L,which was 134.26%higherthanthatproducedbytheoriginalstrain,and this mutan
8、t stillhadgoodgeneticstabilityaftersevenpassages.Meanwhile,thebiomasswasincreasedby118.33%,indicatingthatthegrowthabilityofthemutantstrainwasimprovedcomparedtotheoriginalstrain.TheresultofthisstudyshowthatthecombinationofARTPandMMCcanbeusedasasimpleandeffectivescreeningmethodforexcellentmutantstrain
9、s,whichprovidesareferenceforhighthroughputselectionoftargetstrains.Keywords:glutathione;Pichia pastoris;atmospheric and room temperature plasma;adaptive evolution;strain selectionDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220302-040中图分类号:Q815 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)04-0200-09收稿日期:2022-03-02基金项目:安徽省高校自然科学研究项目(
10、KJ2017A120)第一作者简介:凌思雨(1996)(ORCID:0000-0001-6568-6654),女,硕士研究生,研究方向为微生物发酵工程。E-mail:*通信作者简介:薛正莲(1967)(ORCID:0000-0002-5913-9096),女,教授,硕士,研究方向为工业微生物育种。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 201引文格式:凌思雨,王洲,张会敏,等.常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株J.食品科学,2023,44(4):200-208.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220302-040.h
11、ttp:/LING Siyu,WANG Zhou,ZHANG Huimin,et al.Breeding of a high-yield glutathione-producing strain by atmospheric and room temperature plasma mutagenesis and microbial microdroplet culture systemJ.Food Science,2023,44(4):200-208.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220302-040
12、.http:/谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白类三肽化合物1,广泛存在于大多数真核生物和某些原核生物中2。在生物体内具有还原型和氧化型两种形式3,其中还原型谷胱甘肽占大多数,约为90%4-5。由于其具有抗氧化性6、清除自由基7、解毒8、美白9等 功能,谷胱甘肽被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业3,10。因此,近年来国内外对谷胱甘肽的需求呈现出一种上升趋势11。目前,酵母发酵法生产谷胱甘肽是工业生产上的主流,常用的生产菌种主要包括酿酒酵母12-13、产朊假丝酵母14和毕赤酵母15。由于传统的菌种选育方法过程繁琐、效率低下16,由清华大学与天木生物科技有限公司合作研发的常压室
13、温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术可有效解决上述问题。ARTP诱变具有高突变率、操作简单、诱变速度快且对环境无污染等优点17-18,是一种新型诱变技术,已被广泛应用到各类微生物菌种筛选过程中19。同时,基于液滴微流控技术研发而成的一款全自动高通量微生物微液滴培养(microbial microdroplet culture system,MMC)系统具有高通量、微量化及自动培养和传代等功能20-21,为菌种诱变之后的复杂筛选工作提供了一种高效方法22-23。目前,将ARTP与MMC联合应用于菌种选育的相关研究还鲜见报道
14、,因此具有一定的研究前景和理论价值。为了获得高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株,以实验室保藏的1 株毕赤酵母BY-1作为出发菌株,首先通过ARTP诱变技术并结合梯度浓度1,2,4-三氮唑平板筛选方法,验证在高质量浓度1,2,4-三氮唑抗性平板上生长菌株的谷胱甘肽产量,明显高于低浓度1,2,4-三氮唑平板上生长的菌株。然后进一步以1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用MMC对经过诱变的菌株进行适应性进化,提高出发菌株对1,2,4-三氮唑耐受性的同时筛选出高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株。本实验旨在将ARTP诱变技术与MMC适应性进化联合应用于高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株的选育,相比传统的物理诱变、化学诱变和生物合成
15、学手段 相比,提供一种简便高效的育种方式,具有广泛的市场应用价值。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌种毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,本实验室命名为BY-1。1.1.2 培养基菌种培养用液体和固体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose,YPD)培养基:葡萄糖20g/L,胰蛋白胨20g/L,酵母提取物10g/L;固体培养基中额外添加20g/L琼脂粉。诱变菌株进行摇瓶培养所用液体培养基:葡萄糖20g/L,酵母提取物10g/L,硫酸铵5g/L,无水磷酸二氢钾5g/L,七水硫酸镁5g/L,氯化钠0.1g/L,氯化钙0.1g/L。培
16、养基需115 灭菌30 min后使用。1.1.3 试剂1,2,4-三氮唑、Tris-HCl缓冲液、2-硝基苯甲酸(2-nitrobenzoicacid,DTNB)生工生物工程(上海)股份有限公司;40%乙醇溶液 国药集团化学试剂有限 公司。1.2 仪器与设备ARTP-IIS ARTP诱变育种仪 无锡源清天木生物科技有限公司;MMC-B2 MMC培养仪 洛阳华清天木生物科技有限公司;1510酶标仪 赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;D3024高速微量离心机 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司;ZQZY-78BN恒温培养摇床 上海知楚仪器有限公司;Mixer4K微型旋涡混合仪 生工生物工程(上海)股份
17、有限公司。1.3 方法1.3.1 毕赤酵母ARTP诱变1.3.1.1 BY-1菌株生长曲线制作及对数生长期的确定将活化好的毕赤酵母菌(BY-1)转移至装液量为30 mL的250 mL摇瓶中,置于恒温培养摇床中30、220 r/min过夜培养。将BY-1菌悬液浓度稀释到OD600 nm约1.0,转入MMC专用进样瓶,在MMC系统中创建液滴培养单元,并使用MMC系统自带的光密度检测装置检测液滴中BY-1菌株生长过程中OD600 nm值的变化,用于制作生长曲线,以确定BY-1进入对数生长期的时间。202 2023,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程1.3.1.2 ARTP诱变致死率曲线的制
18、作及最佳ARTP诱变处理时间的确定取对数生长期的BY-1菌液,稀释菌液浓度到OD600 nm约为0.60.8。取10L稀释好的菌液,将其均匀涂布在ARTP专用载片上,置于ARTP诱变育种仪中对BY-1菌株进行诱变处理24。ARTP诱变育种仪配备纯度超过99.99%的氦气;设置处理参数:入射功率120 W,气体流量10 L/min,照射距离2 mm。设置不同诱变处理时间:40、80、120、160、200 s和240 s,并计算不同处理时间的菌株致死率,以绘制ARTP诱变致死率曲线。菌株致死率的计算方法为:将处理结束的载片装入含有990L无菌生理盐水中,经微型旋涡混合仪充分振荡,以未经诱变处理过
19、的菌液作为对照,稀释成不同梯度后均匀涂布于YPD固体培养基。而后置于30 培养箱中培养35 d,并计算致死率。根据ARTP诱变致死率曲线确定最佳诱变处理时间。致死率的计算公式如下:致死率/%=对照组菌落数-实验组菌落数对照组菌落数1001.3.1.3 1,2,4-三氮唑梯度浓度平板法筛选突变菌株将熔化好的YPD固体培养基倒入直径为9 cm的无菌培养皿中,倾斜一定角度(约15),使得位于液面高处的培养基处于培养皿边与皿底之间,待其凝固后,水平放置培养皿,将含有2g/L 1,2,4-三氮唑的YPD培养基加入其中,制得含有不同质量浓度1,2,4-三氮唑(02g/L)的固体平板。随后将经过诱变并稀释好
20、的酵母菌液均匀涂布于梯度平板中,倒置于30 培养箱中静置培养35 d,观察不同质量浓度梯度下菌体的生长情况,并验证在高质量浓度抗性下生长的菌落与其谷胱甘肽产量是否正相关。1.3.1.4 对数生长期初筛菌株在最佳ARTP诱变时间下的ARTP诱变将经过ARTP诱变及梯度平板筛选获得的优势菌株,在最佳诱变时间下再次处理,随后均匀涂布于YPD固体平板中,挑选单菌落用于后续MMC适应性进化。通过ARTP诱变和MMC筛选后获得的毕赤酵母菌株,在30、220 r/min条件下进行摇瓶培养,测定其谷胱甘肽产量和细胞生物量,以优选高产谷胱甘肽的诱变菌株。1.3.2 DTNB法测定谷胱甘肽产量取2 mL摇瓶培养液
21、,8 000 r/min离心5 min后获得上清液和细胞沉淀,使用上清液检测胞外谷胱甘肽产量,使用细胞沉淀检测胞内谷胱甘肽产量,本实验谷胱甘肽总产量为胞外和胞内产量之和25-26。对于胞内谷胱甘肽的检测需要额外使用40%乙醇溶液,30 水浴破壁2 h,8 000 r/min离心5 min后取上清液进行显色反应。在pH 8.0的Tri-HCl缓冲液中,谷胱甘肽与DTNB反应可以生成黄色的5-硫代-2硝基苯甲酸,在波长412 nm处有最大吸收峰,利用酶标仪检测OD412 nm,通过标准曲线法检测谷胱甘肽产量27。1.3.3 细胞生物量的测定取2 mL摇瓶培养液,8 000 r/min离心5 min
22、,弃上清液,而后用蒸馏水洗涤菌体3 次,85 烘干至质量恒定,减去空离心管质量后除以摇瓶培养液体积2 mL即可得到细胞干质量(g/L)。1.3.4 优选菌株的MMC适应性进化将经过ARTP诱变且经过摇瓶培养证实生产性能较稳定的菌株BY-1-26,接入到YPD液体培养基中,30、220 r/min条件下过夜培养,调节OD600 nm,使其控制在1.0以下。设置传代方式(time)及传代参数(24 h)后,在不同浓度梯度的1,2,4-三氮唑筛选因子条件下进行BY-1-26菌株的MMC适应性进化,实时检测OD600 nm以跟踪菌株的适应性进化生长情况。随着培养时间的延长,1,2,4-三氮唑浓度逐渐递
23、增,达到最高设定浓度时,将生长情况良好的液滴提取出来,通过平板划线,分离单菌落后,作为下次实验的出发菌株。1.3.5 突变菌株遗传稳定性分析将最终经过筛选获得的优势菌株,经过固体平板划线连续传代7 次,于30、220 r/min条件下检测每代的生长情况(生物量)及谷胱甘肽产量,验证其遗传稳定性。1.4 数据处理实验数据采用Excel2019进行处理,图像采用Origin2018进行绘制。实验结果以 s表示。2 结果与分析2.1 毕赤酵母菌株的ARTP诱变筛选条件BY-1毕赤酵母菌株为ARTP诱变的出发菌株,其具有代谢产生谷胱甘肽能力,已知其在摇瓶培养48 h可达到最高谷胱甘肽产量(胞内产量与胞
24、外产量总量)(133.240.86)mg/L,对应生物量(15.220.21)g/L(图1a)。图1b为BY-1菌株在MMC培养中的生长曲线,不同液滴培养单元之间一致性良好,菌株BY-1从3 h起开始进入对数生长期,20 h后进入稳定期。进一步检测BY-1菌株在不同ARTP诱变处理时间下的致死率,由 图1c可知,随着处理时间的延长,菌株的死亡率也在逐渐提高。处理时间为120 s时,致死率高达80%;处理时间增加到160 s,致死率为90%;进一步增加处理时间至200 s,致死率达到100%。根据文献报道28,致死率在80%90%之间,更有利于后续诱变菌株的筛选工作。为此,考虑到诱变菌株的筛选效
25、率,本研究将160 s确定为后续ARTP诱变的最佳处理时间。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 20301140a1204080160100206061810142016812谷胱甘肽产量/(mg/L)生物量/(g/L)23重复实验胞内产量胞外产量生物量drop1drop2001020304050515253545212141618b10864OD600 nm培养时间/hdrop7drop8drop9drop10drop3drop4drop5drop600408012016020024030120c9060致死率/%处理时间/s图 1 菌株BY-1的谷胱甘肽产量及生物量(a
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