Casp-8通过调控NLR...减轻脓毒症引起的急性肺损伤_翟延评.pdf
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1、东南大学学报(医学版)J Southeast Univ(Med Sci Edi)2023,Feb;42(1):64-71thelial cells with autophagy-mediated protection against albu-min-induced injury J Exp Cell es,2018,370(2):198 15完颜萍萍 慢性间歇性缺氧对肾脏纤维化的影响及相关机理研究 D 甘肃:兰州大学,2020 16LIU M,NING X,LI,et al Signalling pathways involved inhypoxia-induced renal fibros
2、is J J Cell Mol Med,2017,21(7):1248-1259 17FENANDEZ-PATON C,LEUNG D Emergence of a metal-loproteinase/phospholipase A2 axis of systemic inflammation J Metalloproteinases Med,2015(2):29-38 18YU W,KE X,LI M,et al Downregulation of AB7 and cave-olin-1 increases MMP-2 activity in renal tubular epithelia
3、lcells under hypoxic conditions J Open Med(Wars),2021,16(1):1428-1437 19XU Q,LIU L,YANG Y,et al Effects of ab7 gene up-regula-tion on renal fibrosis induced by unilateral ureteral obstruc-tion J Braz J Med Biol es,2020,53(4):e9220 20YANG Y,WANG J,ZHANG Y,et al Hypoxic tubular epithe-lial cells regul
4、ate the angiogenesis of HMEC-1 cells via medi-ation of ab7/MMP-2 axis J Aging,2021,13(20):23769-23779 21MIKI T,TAKEGAMI Y,OKAWA K,et al The reversion-in-ducing cysteine-rich protein with Kazal motifs(ECK)inter-acts with membrane type 1 matrix metalloproteinase andCD13/aminopeptidase N and modulates
5、their endocytic path-ways J J Biol Chem,2007,282(16):12341-12352收稿日期2022-08-29 修回日期2022-11-12基金项目广东省医学科研基金项目(B2021139);广州市卫生健康科技一般引导项目(20221A010070)作者简介翟延评(1987 ),女,山东曲阜人,主治医师。E-mail:zhaiyanping0426163 com引文格式翟延评,何耀军,潘嘉宇,等 Casp-8 通过调控 NLP3 炎性小体介导的细胞焦亡减轻脓毒症引起的急性肺损伤J 东南大学学报(医学版),2023,42(1):64-71 论著 Ca
6、sp-8 通过调控 NLP3 炎性小体介导的细胞焦亡减轻脓毒症引起的急性肺损伤翟延评,何耀军,潘嘉宇,王志敏,张春云(广州医科大学附属第五医院 ICU,广东高校生物靶向诊治与康复重点实验室,广东 广州510700)摘要目的:分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8(Casp-8)对脓毒症引起的急性肺损伤(ALI)的作用及其相关分子机制。方法:对 40 只 C57BL/6 小鼠使用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症诱导的小鼠 ALI 模型,将造模成功的小鼠随机分为模型组(CLP 组)和 CLP+Casp-8 抑制剂组(CLP+Z-IETD-FMK 组),每组20 只。另取 20 只正常饲养的小鼠设为假
7、手术组(sham 组)。采用称质量法测定小鼠肺组织湿干质量比值(W/D),HE 染色观察小鼠肺组织病理变化,TUNEL 染色检测肺组织细胞凋亡情况,ELISA 检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子水平,qT-PC 检测肺组织中 Casp-8 mNA 表达,Western blotting 检测小鼠肺组织中Casp-8 蛋白、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(NLP3)炎性小体及细胞焦亡相关蛋白表达。结果:与sham 组比较,CLP 组小鼠 24 h 存活率明显降低(P 0 05);小鼠肺组织充血水肿,肺泡结构严重破坏,肺间质内大量炎症细胞浸润;肺组织 W/D,细胞凋亡率,BALF
8、 中肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素(IL)-6、IL-1、IL-18 水平均显著升高(P 0 05);肺组织中 Casp-8 mNA 和蛋白表达水平,NLP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、切割蛋白 D(GSDMD)蛋白表达水平均显著升高(P 0 05)。与 CLP 组比较,CLP+Z-IETD-FMK 组小鼠存活率明显升高(P 0 05);小鼠肺泡结构破坏减轻,肺部炎症细胞浸润减少;肺组织 W/D,细胞凋亡率,BALF 中 TNF-、IL-6、IL-1、IL-18 水平均显著降低(P 460.05);肺组织中 Casp-8 mNA 和
9、蛋白表达水平,NLP3、ASC、Caspase-1、GSDMD 蛋白表达水平均显著降低(P 0 05)。结论:Casp-8 通过调控 NLP3 炎性小体介导的细胞焦亡减轻脓毒症引起的 ALI。关键词Casp-8;脓毒症;急性肺损伤;NLP3 炎性小体;细胞焦亡;细胞凋亡 中图分类号631 2 文献标志码A 文章编号1671-6264(2023)01-0064-08doi:10 3969/j issn 1671-6264 2023 01 009Casp-8 attenuates sepsis-induced acute lung injury through regulation ofNLP3
10、inflammasome-mediated pyroptosisZHAI Yanping,HE Yaojun,PAN Jiayu,WANG Zhimin,ZHANG Chunyun(ICU,Key Laboratory of Biological Targeted Diagnosis,Treatment and ehabilitation,Guangdong University,the Fifth AffiliatedHospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510700,China)AbstractObjective:To ana
11、lyze the effect of cysteine aspartate proteolytic enzyme-8(Casp-8)on sepsis-inducedacute lung injury(ALI)and its related molecular mechanism Methods:Forty C57BL/6 mice were used to estab-lish sepsis-induced ALI model by cecal ligation and puncture(CLP)The successfully modeled mice were randomlydivid
12、ed into model group(CLP group)and CLP+Casp-8 inhibitor group(CLP+Z-IETD-FMK group),twenty ineach group Another twenty normal mice were divided into sham operation group(sham group)The wet/dry weightratio(W/D)of lung tissue was measured by weighting method,the pathological changes of lung tissue were
13、 ob-served by HE staining,the apoptosis of lung tissue cells was detected by TUNEL staining,the levels of inflammato-ry cytokines in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were detected by ELISA,the expression of Casp-8 mNA inlung tissue was detected by qT-PC,and the expression of Casp-8 protein,nucleoti
14、de binding oligomerization do-main like receptor protein 3(NLP3)inflammasome and apoptosis-related protein were detected by Western blot-ting esults:Compared with the sham group,the 24 h survival rate of mice in CLP group was significantly de-creased(P 0 05)The lung tissue of mice was congested and
15、edematous,the alveolar structure was seriouslydamaged,and a large number of inflammatory cells were infiltrated in the lung stroma Lung W/D,apoptosis rate,the levels of tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin(IL)-6,IL-1 and IL-18 in BALF were significantly in-creased(P 0 05)The expression levels of
16、 Casp-8 mNA and protein,NLP3,apoptosis-associated speck-likeprotein containing a CAD(ASC),cysteine aspartate proteolytic enzyme-1(Caspase-1)and gasdermin D(GSD-MD)protein in lung tissue were significantly increased(P 0 05)Compared with CLP Group,the 24 h survivalrate of mice in CLP+Z-IETD-FMK group
17、was significantly increased(P 0 05)The destruction of alveolar struc-ture and the infiltration of inflammatory cells in lungs were reduced in mice Lung W/D,apoptosis rate,the levelsof TNF-,IL-6,IL-1 and IL-18 in BALF were significantly decreased(P 0 05)The expression levels ofCasp-8 mNA and protein,
18、NLP3,ASC,Caspase-1 and GSDMD protein in lung tissue were significantly de-creased(P 0 05)Conclusion:Casp-8 attenuates sepsis-induced ALI by regulating NLP3 inflammasome-medi-ated pyroptosis Key wordscysteine aspartate proteolytic enzyme-8;sepsis;acute lung injury;NLP3 inflammasome;pyropto-sis;apopto
19、sis脓毒症是一种由病原体诱导的过度免疫反应引起的危及生命的疾病,通常会导致多器官衰竭1。该疾病已成为与急性肺损伤(acute lung injury,ALI)相关的主要诱发临床因素之一,脓毒症诱发的 ALI 是一种包56翟延评,等 Casp-8 通过调控 NLP3 炎性小体介导的细胞焦亡减轻脓毒症引起的急性肺损伤括多种急性呼吸衰竭疾病的临床综合征,其特征是肺泡上皮细胞和内皮细胞损伤、肺部炎症细胞浸润以及出现充血水肿等2。当前,脓毒症 ALI 的治疗包括抗生素、糖皮质激素以及呼吸支持等,但抗菌药物长期使用会产生耐药菌,并且伴随一系列不良反应,治疗效果并不理想,脓毒症诱导 ALI 的死亡率仍居高
20、不下3-4。在脓毒症诱导 ALI 病理进程中,炎症反应和凋亡途径的失调导致肺泡上皮细胞的破坏、上皮通透性的增加以及水肿液流入肺泡空间,最终促进肺损伤进程5。因此,靶向炎症和凋亡途径的治疗策略可能是改善脓毒症所致 ALI 的有效方法。细胞焦亡又称细胞炎性坏死,是机体一种天然的免疫反应,在抗击感染过程中发挥着重要作用。脓毒症小鼠肺组织中存在典型的细胞焦亡改变6,相关体内外实验表明抑制细胞焦亡可减轻脓毒症引起的 ALI7。这些研究结果提示,细胞焦亡可能是脓毒症 ALI 发生的关键机制之一。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8(cysteine aspartate proteolyticenzyme-8,C
21、asp-8)是一种顶端半胱氨酸天冬酶,参与细胞凋亡的程序性细胞死亡形式,是外源性凋亡的重要启动子,对哺乳动物的发育和免疫至关重要8。最新研究9 发现,Casp-8 是控制细胞焦亡的分子开关,可以防止胚胎发育和成年期的组织损伤。亦有研究10 报道,Casp-8 作为效应分子参与 ALI 中肺泡巨噬细胞的焦亡。脓毒症诱导的 ALI 中 Casp-8 与细胞焦亡的研究尚未见报道。因此,本研究旨在探索 Casp-8在脓毒症诱导 ALI 中的作用及其对细胞焦亡的调控作用。1材料与方法1 1材料健康雄性 C57BL/6 小鼠,6 8 周龄,体质量 18 22 g,SPF 级,购自广东省实验动物监测所,生产
22、许可证号为 SCXK(粤)2018-0044。小鼠置于室温20 22、相对湿度 55%70%、12 h 光暗交替的标准环境中饲养,自由饮水、进食。Casp-8 抑制剂 Z-IETD-FMK(纯度:98%,规格:10 mg)购自美国 AbMole 公司;HE 染色试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司;TUNEL 染色试剂盒、qT-PC 实验试剂盒均购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1、IL-18 ELISA检测试剂盒购自武汉赛培生物科技有限公司;二喹啉甲酸(bicin
23、choninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒购自上海科艾博生物科技有限公司;放射免疫沉淀分析(radioimmunoprecipitation assay,IPA)裂解液、增强化学发光试 剂(enhanced chemiluminescence,ECL)均 购 自MCE 公司;兔抗 Casp-8 单克隆抗体、兔抗核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(nucleotide blingding oli-gomerization domain-like receptor protein 3,NLP3)多克隆抗体、兔抗凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associ-ated speck-l
24、ike protein containing a CAD,ASC)单克隆抗体、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine aspar-tate proteolytic enzyme-1,Caspase-1)单克隆抗体、兔抗切割蛋白 D(gasdermin D,GSDMD)单克隆抗体、兔抗-肌动蛋白(-actin)多克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HP)结合的山羊抗兔 IgG 二抗均购自英国 Abcam 公司。1 2实验方法1 2 1模型建立40 只小鼠适应环境 1 周后,参考文献 11使用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation andpunc
25、ture,CLP)建立脓毒症诱导的小鼠 ALI 模型,操作如下:腹腔注射 1%戊巴比妥钠(50 mgkg1)麻醉小鼠,将小鼠以仰卧位固定于实验台,在腹部中线做纵向切口暴露盲肠,使用无菌 4-0 丝线在距离尖端 1 cm 处结扎盲肠,并用 20 号无菌针头穿刺结扎部位的盲肠组织,随后轻轻挤压盲肠至有少量肠内容物后,将盲肠放回腹腔,逐层缝合手术切口。术后立即皮下注射 37 预热的无菌生理盐水以促进液体复苏。术后观察小鼠基本情况和存活率。12 2实验分组与给药处理将造模的 40 只小鼠随机分为模型组(CLP 组)和 CLP+Casp-8 抑制剂组(CLP+Z-IETD-FMK 组),每组20 只。另
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