瓜蒌皮提取物通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响.pdf
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1、吴俊荣等 瓜蒌皮提取物通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响 第 8 期瓜蒌皮提取物通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子 表达的影响吴俊荣 张嘉琳 吕贵东 黄雯静 邹方鹏(济南市中西医结合医院肾病风湿科,济南 271100)中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2023)08-1585-05摘要 目的:探讨瓜蒌皮提取物(PT)通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响。方法:采用5.5 mmol/L和30 mmol/L的D-葡萄糖处理人肾小管上皮细胞HK-2,记为对照组和高糖(HG)组;分别用12.5、2
2、5、50 g/ml的PT处理细胞,进行高糖处理,记为HG+PT-L组、HG+PT-M组、HG+PT-H组;采用脂质体法将vector和NQO1转染至细胞后,进行高糖处理,记为HG+vector组和HG+NQO1组;si-NC和si-NQO1转染细胞后,用50 g/ml PT和高糖处理细胞,记为HG+PT+si-NC组和HG+PT+si-NQO1组。MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测Bax、Bcl-2、NQO1蛋白表达;ELISA检测IL-1、IL-10、TNF-表达水平。结果:HG组细胞活力、Bcl-2、NQO1蛋白表达明显低于对照组,细胞凋亡率、Bax蛋
3、白表达、IL-1、IL-10、TNF-水平明显高于对照组。HG+PT-L组、HG+PT-M组、HG+PT-H组细胞活力、Bcl-2、NQO1蛋白表达明显高于HG组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1、IL-10、TNF-水平明显低于HG组。HG+NQO1组NQO1、Bcl-2蛋白表达、细胞活力明显高于HG+vector组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1、IL-10、TNF-水平明显低于HG+vector组。HG+PT+si-NQO1组NQO1、Bcl-2蛋白表达、细胞活力明显低于HG+PT+si-NC组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1、IL-10、TNF-水平明显高于HG+PT+
4、si-NC组。结论:PT通过上调NQO1表达减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡和炎症损伤。关键词 瓜蒌皮提取物;NQO1;高糖;人肾小管上皮细胞;炎症因子Effect of pericarpium trichosanthis extract on expressions of inflammatory factors in human renal tubular epithelial cells induced by high glucose by regulating NQO1WU Junrong,ZHANG Jialin,LYU Guidong,HUANG Wenjing,ZOU Fang
5、peng.Department of Nephrology and Rheumatology,Jinan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Jinan 271100,ChinaAbstract Objective:To investigate the effect of pericarpium trichosanthis(PT)extract on expressions of inflammatory factors in human renal tubular epithelial cells i
6、nduced by high glucose through NQO1.Methods:Human renal tubular epithelial cell HK-2 was treated with 5.5 mmol/L and 30 mmol/L D-glucose,which were recorded as control group and high glucose(HG)group;cells were treated with PT extract at the concentration of 12.5,25,50 g/ml,and treated with high glu
7、cose,which were recorded as HG+PT-L group,HG+PT-M group and HG+PT-H group;after transfecting vector and NQO1 into cells according to liposome method,they were treated with high glucose,which were recorded as HG+vector group and HG+NQO1 group;after transfecting the cells with si-NC and si-NQO1,cells
8、were treated with 50 g/ml of PT extract and high glucose,which were recorded as HG+PT+si-NC group and HG+PT+si-NQO1 group.MTT was used to detect cell viability;flow cytometry was used to detect cell apoptosis;Western blot was used to detect protein expressions of Bax,Bcl-2 and NQO1;ELISA was used to
9、 detect expression levels of IL-1,IL-10 and TNF-.Results:Cell viability,Bcl-2 and NQO1 protein expressions in HG group were significantly lower than those in control group;while apoptosis rate,Bax protein expression,IL-1,IL-10 and TNF-levels were significantly higher than those in control group.Cell
10、 viability,Bcl-2,NQO1 protein expressions of HG+PT-L group,HG+PT-M group and HG+PT-H group were significantly higher than those in HG group;while apoptosis rate,Bax protein expression,IL-1,IL-10,TNF-levels were significantly lower than that in HG group.Expressions of NQO1,Bcl-2 protein and cell viab
11、ility in HG+NQO1 group were significantly higher than those in HG+vector group;while apoptosis rate,Bax protein expression,IL-1,IL-10 and TNF-levels were significantly lower than those in HG+vector group.Expressions of NQO1,Bcl-2 protein and cell viability in HG+PT+si-NQO1 group were significantly l
12、ower than those in HG+PT+si-NC doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.004本文为山东省中医药科技发展计划项目(2017-452)。山东第一医科大学临床医学部,泰安 271000。通信作者,E-mail:。作者简介:吴俊荣,女,硕士,副主任医师,主要从事肾病风湿方面的研究,E-mail:。1585中国免疫学杂志2023 年第 39 卷group,while apoptosis rate,Bax protein expression,IL-1,IL-10 and TNF-levels were significantly high
13、er than that in HG+PT+si-NC group.Conclusion:PT extract can reduce apoptosis and inflammatory damage of human renal tubular epithelial cells induced by high glucose by up-regulating expression of NQO1.Key words Pericarpium trichosanthis extract;NQO1;High glucose;Human renal tubular epithelial cells;
14、Inflammatory factors糖尿病患者能引发多种并发症,其中有 30%40%患者发展为糖尿病肾病,也是糖尿病患者病死率较高的原因之一1。有研究证实糖尿病肾病发展机制受肾小管上皮细胞影响,其中细胞凋亡、氧化应激和炎症损伤能够引起肾小管上皮细胞损伤2。瓜蒌皮是葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥成熟果实,主治清热化痰、利气宽胸等,民间常用于治疗痰热咳嗽、胸闷胁痛等疾病3。现代药理学研究结果显示,瓜蒌皮在心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等方面取得了一定效果4。有研究结果显示,瓜蒌皮提取物(pericarpium trichosanthis,PT)能下调NF-B表达,抑制 caspase-3活化
15、,进而抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,但对高糖诱导的人肾小管上皮细胞研究机制尚不明确5。依赖还原型辅酶/醌氧化还原酶 1NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1 是一种高度保守功能蛋白,在多种组织内异常表达6-7,最近的研究结果显示,NQO1在高糖诱导的人肾小管上皮细胞内表达下调,miR-4429通过靶向负调控NQO1减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡,提高细胞的抗氧化和抗炎能力8。本研究通过高糖处理人肾小管上皮细胞,探讨PT是否通过调控NQO1表达影响高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达。1 材料与方法 1.1材料人肾小管上皮细胞 HK-2购于上海通派
16、生物;瓜蒌皮购于同仁堂,经鉴定后取干燥成熟果实,按照文献 9 方法在本实验室制备瓜蒌皮提取物,取瓜蒌皮用水浸泡,文火煎煮 2 h,过滤并浓缩,真 空 干 燥,即 为 PT;胎 牛 血 清(16000031)、DMEM 培养基(10536001)购于美国 Gibco 公司;青霉素(A6027)、链霉素(A6014)、D-葡萄糖(G8175)购于美国 Sigma 公司;Lipofectamine 2000 试剂盒(R1094)购于上海润成生物;vector、NQO1、si-NC、si-NQO1购于赛默飞世尔;MTT试剂盒(M1011)、凋亡试剂盒(2362524)购于上海恒斐生物;Bax 抗体(5
17、012S)、Bcl-2 抗体(2563S)、NQO1 抗体(3182)、-actin抗体(4970)购于美国CST公司;HRP标记的二抗(HCV-223)购于武汉艾美捷公司;IL-1试剂盒(H002)、IL-10试剂盒(H007)、TNF-试剂盒(H043-1)购于南京建成生物工程研究所。1.2方法1.2.1细胞培养和分组HK-2细胞用含10%胎牛血清和双抗(100 U/ml青霉素与100 g/ml链霉素)的DMEM培养基培养,然后在37、含5%CO2的恒温培养箱内培养,观察HK-2细胞生长状态,融合度为85%时进行消化传代培养。取对数期的HK-2细胞,按参考文献 8 将细胞用5.5 mmol
18、/L和30 mmol/L的D-葡萄糖处理,记为对照组和高糖(HG)组;按参考文献 5 用浓度为 12.5、25、50 g/ml 的 PT 处理HK-2 细胞,并进行高糖处理,记为 HG+PT-L 组、HG+PT-M组、HG+PT-H组;按照Lipofectamine 2000使用说明书将vector和NQO1转染至HK-2细胞,6 h后更换细胞液,进行高糖处理,记为HG+vector组和HG+NQO1组;将si-NC和si-NQO1转染至HK-2细胞后,转染6 h后更换细胞液,采用50 g/ml PT和高糖处理细胞,记为HG+PT+si-NC组和HG+PT+si-NQO1组。1.2.2MTT检
19、测细胞活力收集1.2.1各组细胞,以3104个/孔接种于96孔板,将各组细胞继续培养48 h,加入20 l MTT试剂继续培养4 h,加入150 l DMSO 试剂,溶解后置于酶标仪,检测各孔 490 nm处的吸光度值,计算细胞活力,细胞活力(%)=实验组吸光度值/对照组吸光度值100%。1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡收集 HK-2 细胞,以2105个/孔接种于6孔板,按照1.2.1方法处理各组细胞并培养48 h,加入结合缓冲液制成单细胞悬液,依据凋亡试剂盒说明书加入 Annexin V-FITC 和 PI 溶液各 5 l,避光反应 15 min,置于 Attune NxT流式细胞仪,21
20、CFR part 11软件分析细胞凋亡情况。凋亡率(%)=早期凋亡细胞比例(%)+晚期凋亡细胞比例(%)。1.2.4Western blot 检测 Bax、Bcl-2、NQO1 蛋白表达收集1.2.1各组细胞,加入蛋白裂解液,置于冰上反应30 min,BCA法定量分析蛋白浓度。取30 g蛋白样品进行SDS-PAGE分离蛋白,将分离蛋白转膜,脱脂奶粉封闭培养1.5 h,加入Bax(1 500)、Bcl-2(1 500)、NQO1(1 500)和-actin(1 1 000)抗体于4 孵育过夜,洗涤 3 次,加入 HRP 标记的二抗 (1 2 000),4 孵育1.5 h,洗涤3次,滴加ECL显色
21、液显影,采用 Quantityone 软件分析蛋白条带灰度值。1586吴俊荣等 瓜蒌皮提取物通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响 第 8 期1.2.5ELISA检测IL-1、IL-10、TNF-表达收集1.2.1各组细胞,4 条件下12 000 r/min离心15 min后收集上清液,按照IL-1、IL-10、TNF-ELISA试剂盒说明书检测IL-1、IL-10、TNF-表达。1.3统计学分析采用SPSS22.0软件统计分析实验所得数据,计量结果以x s表示,多组间比较用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果 2.1PT对高
22、糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡的影响与对照组相比,HG组细胞活力、Bcl-2蛋白表达显著降低(P0.05),细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P0.05);与HG组相比,HG+PT-L、HG+PT-M、HG+PT-H组细胞活力、Bcl-2蛋白表达显著升高(P0.05),细胞凋亡率、Bax 蛋白表达显著降低(P0.05)。见图1、表1。2.2PT对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响与对照组相比,HG 组 IL-1、IL-10、TNF-表达显著升高(P0.05);与HG组相比,HG+PT-L、HG+PT-M、HG+PT-H 组 IL-1、IL-10、TNF-表达显著降低(P0.05)。见
23、表2。2.3PT 对高糖诱导的人肾小管上皮细胞 NQO1 蛋白表达的影响与对照组相比,HG组NQO1蛋白表达显著降低(P0.05);与HG组相比,HG+PT-L、HG+PT-M、HG+PT-H 组 NQO1 蛋白表达显著升高(P0.05)。见图2、表3。图2PT对高糖诱导的人肾小管上皮细胞NQO1蛋白表达的影响Fig.2Effect of PT on expression of NQO1 protein in human renal tubular epithelial cells induced by high glucose表2PT对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响(x s,p
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