复合益生菌对绍兴鸭血清生化、盲肠短链脂肪酸及微生物区系的影响.pdf
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1、单胃动物2023年第44卷第21期 总第690期复合益生菌对绍兴鸭血清生化、盲肠短链脂肪酸及微生物区系的影响 卢丽枝1 雷丽莉2 章岳军2 高秋玲2 吴永峰3 吴忠才4 沈水宝2 张淑芳2*(1.广西壮族自治区畜牧站,广西南宁 530022;2.广西大学动物科学技术学院,广西南宁 530004;3.英杰(长沙)生物科技有限公司,湖南长沙 410000;4.广西桂柳牧业集团,广西桂林 541000)摘 要:试验旨在探究嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成的复合益生菌在不同添加量下对绍兴鸭血清生化指标、盲肠短链脂肪酸及微生物区系的影响。试验选用健康、体重相近1日龄绍兴鸭1 200只
2、,随机分为4组,每组5个重复,每个重复60只。对照组饲喂基础饲粮,A组在基础饲粮的基础上添加100 mg/kg复合益生菌,B组在基础饲粮的基础上添加200 mg/kg复合益生菌,C组在基础饲粮的基础上添加300 mg/kg复合益生菌。预试期3 d,正试期30 d。结果表明:与对照组相比,各试验组的平均日增重(ADG)和平均日采食(ADFI)量在数值上有增加趋势(P0.05);各试验组的料重比显著降低(P0.05);各试验组血清中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)含量极显著增加(P0.05)。各试验组盲肠中乙酸含量显著增加(P0.05),A组盲肠异戊酸含量差异显著(P0.05)。基于
3、门水平,各试验组拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度均差异显著(P0.05);基于属水平,差异菌属瘤胃球菌属(Ruminococcus_torquesgroup)和拉氏鳞毛蕨属(Lachnoclo stridium)差异显著(P0.05);the ratio of feed to gain in complex probiotics groups was significantly decreased(P0.05);Serum IgM and IgA were significantly increased(P0.05).Compared with t
4、he control group,the acetic acid content in cecum of group A,B and C was significantly increased(P0.05),and the supplemental dose in the combined diet was 100-200 mg/kg.Key words:compound probiotics;Shaoxing duck;serum biochemistry;short chain fatty;microflora我国农业农村部公告第 194 号规定,自 2020 年7 月 1日起停止生产使用
5、含有生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。自此,我国正式迎来了饲料无抗时代1。但随着禁抗时代的到来,我国养殖业面临的新问题是畜禽抵抗力降低,患病率有所增加,生产效益降低,给养殖场(户)带来不小的经济损失,因此寻找新的替抗产品势在必行。益生菌作为一种活的微生物,当宿主体内积累到一定剂量时可以起到增强机体免疫力,减少肠道疾病的效果2。益生菌被广泛应用在食品、医药和农业生产,通过定植在动物体内调节宿主黏膜与免疫系统,调节肠道菌群,促进营养物质吸收保持肠道健康3。因此,益生菌对养殖动物的影响研究也受到广泛关注。阮胜钢等4研究发现,在雏鸭饲料中添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的复合益生菌,增加了雏
6、鸭的免疫能力,并显著提高了 28 日龄雏鸭的平均日增重;Song等5研究发现,在热应激的肉鸡饲粮中添加由植物乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合益生菌可有效增加小肠中乳酸杆菌等有益菌群定植。鸭具有耐寒、耐粗饲、免疫力强,早期生长较快,但是由于现代集约化养殖条件,养殖密度大、饮水条件差和冷热应激较大,造成鸭容易出现肠道问题6。研究旨在探究嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成的复合益生菌在不同添加量下对绍兴鸭血清生化、盲肠短链脂肪酸及微生物区系的影响,为益生菌在改善鸭肠道健康以及免疫方面提供科学依据。1 材料与方法1.1 试验材料试验所用复合益生菌购自英杰(长沙)生物科技
7、有限公司提供,主要有效成分为嗜酸乳杆菌 1109 CFU/g、屎肠球菌 1109 CFU/g、枯草芽孢杆菌 1109 CFU/g、地衣芽孢杆菌1109 CFU/g。试验所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。试验动物和养殖场地均由广西桂柳牧业集团提供。1.2 试验设计与饲养管理试验采用单因素完全随机设计,选取同一批次健康、体重相近1日龄的绍兴鸭1 200只,随机分4组,每组5个重复,每个重复60只。对照组饲喂基础饲粮,A组在基础饲粮基础上添加100 mg/kg复合益生菌,B组在基础饲粮基础上添加200 mg/kg复合益生菌,C组在基础饲粮基础上添加300 mg/kg复合益生菌。预试期3
8、 d,正试期30 d。饲养试验在广西桂柳牧业集团养殖场进行,均采用网上平养方式,自由采食和饮水,免疫程序按照鸭场现行常规免疫进行。1.3 基础饲粮基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,参考NY/T 8272004 绍兴鸭饲养技术规程7并结合试验鸭场企业标准设计。试验全期饲喂颗粒料,基础饲粮组成以及营养水平见表1。61单胃动物2023年第44卷第21期 总第690期表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)项目原料组成(%)玉米糙米小麦面粉磷酸氢钙 豆粕发酵小麦麸生物发酵饲料鱼粉石粉 猪油赖氨酸蛋氨酸苏氨酸氯化钠 碳酸氢钠氯化胆碱蒙脱石复合预混合饲料合计营养水平代谢能(ME,MJ/kg)粗蛋白(CP)钙(C
9、a)总磷(TP)赖氨酸(Lys)蛋氨酸(Met)含量26.8015.0010.005.001.0025.503.003.000.506.502.000.450.200.050.250.100.100.250.30100.0011.3019.000.900.551.200.48注:1.生物发酵饲料以玉米、豆粕、麦麸为底物发酵的饲料;2.复合预混合饲料为每千克饲粮提供:Fe100 mg、Cu 12 mg、I 0.5 mg、Mn 80 mg、Zn 84 mg、Se 0.1 mg、VA 4 000 IU、VB1 0.8 mg、VB2 5 mg、VB6 1.5 mg、VB12 0.05 mg、VD3 8
10、00 IU、VE 30 IU、VK3 0.5 mg、D-泛酸10 mg、叶酸1.5 mg、烟酸20 mg、生物素0.4 mg;3.代谢能为计算值,其余营养水平均为实测值。1.4 样品采集于正试期第30天,试验鸭禁食12 h,正常饮水,每个重复随机选取 1 只绍兴鸭进行翅下静脉采血,3 000 r/min离心15 min后,用移液枪将血清移到1.5 mL离心管中,-20 保存,用于测定血清生化指标和免疫指标;随后进行安乐死屠宰,取盲肠内容物,-80 保存,用于测定盲肠短链脂肪酸和微生物区系。1.5 检测指标与方法1.5.1 生长性能分别在试验开始和结束当天以重复为单位对其进行空腹称重,用于计算平
11、均日增重;以每组每个重复为单位记录试验鸭的投料量以及剩余料量,用于计算平均日采食量和料重比。平均日增重(g)=(末体重-初体重)/试验天数平均日采食量(g)=(投料量-剩余料量)/试验天数/试验鸭数料重比=平均日采食量/平均日增重1.5.2 血清生化指标采用购自南京建成生物工程研究所有限公司的ELISA试剂盒,使用酶标仪测定血清中总蛋白(TP)、白 蛋 白(ALB)、谷 丙 转 氨 酶(ALT)、谷 草 转 氨 酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)等血清生化指标以及血清免疫球蛋白 M、A、G(IgM、IgA、IgG)指标含量
12、,严格按照试剂盒说明书操作。1.5.3 盲肠短链脂肪酸测定盲肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs)的含量;采用直接进样的气相色谱法和内标定量能计算法测定分析盲肠内容物中短链脂肪酸的含量。1.5.4 盲肠微生物区系试验结束当天,在无菌的操作下取盲肠内容物1.52.0 mL装入冻存管,-80 保存,然后干冰送往上海生物医药科技有限公司委托进行16S rRNA V3V4微生物区系检测。1.6 数据统计与分析试验数据经Excel简单整理后,使用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并以Duncan s法进行多重比较。结果以“平均数标准误”表示,以P0.05为差异显著,P0
13、.05),但3个试验组平均日增重分别增加2.4%、5.3%、4.6%,平均日采食量分别增加2.0%、2.5%、3.1%;A、B、C组绍兴鸭的料重比均低于对照组,其中B、C组显著低于对照组(P0.05);A、B、C组绍兴鸭的 IgM和 IgA62SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期含量极显著提高(P0.05)。2.3 复合益生菌对绍兴鸭盲肠短链脂肪酸含量的影响由表4可知,与对照组相比,A、B、C组绍兴鸭盲肠乙酸含量显著提高(P0.05);A组绍兴鸭盲肠异戊酸含量显著提高(P0.05),盲肠异戊酸含量显著降低50%(P0.05),不含有相同小写字母表示差异显著(P0.
14、05),不含有相同大写字母表示差异极显著(P0.01);下表同。表3 复合益生菌对绍兴鸭血清生化指标的影响项目总胆红素(TBIL,mol/L)总蛋白(TP,g/L)白蛋白(ALB,g/L)球蛋白(GLOB,g/L)白蛋白/球蛋白碱性磷酸酶(ALP,U/L)谷丙转氨酶(ALT,U/L)谷草转氨酶(AST,U/L)谷草转氨酶/谷丙转氨酶葡萄糖(GLU,mmol/L)尿素氮(BUN,mmol/L)肌酐(CREA,mol/L)尿酸(UA,mol/L)三酰甘油(TG,mmol/L)总胆固醇(TC,mmol/L)高密度胆固醇(HDL-C,mmol/L)低密度胆固醇(LDL-C,mmol/L)免疫球蛋白M(
15、IgM,g/L)免疫球蛋白A(IgA,g/L)免疫球蛋白G(IgG,g/L)对照组0.640.0761.005.7023.770.7037.235.880.640.06185.4048.6727.621.8024.506.340.900.244.720.650.670.029.601.83264.4018.3215.885.564.972.470.400.111.690.950.050.02C0.120.10C0.160.02A组0.680.1065.422.3023.260.9642.161.900.550.03179.0041.0126.422.1719.101.030.740.166.2
16、50.520.570.059.200.86252.4045.1010.520.663.230.680.380.080.840.070.090.02B0.160.09B0.180.01B组0.640.1268.363.1425.740.7742.622.800.600.03102.6020.8526.024.7717.921.640.750.096.100.380.550.0210.602.09222.2040.3811.321.483.260.400.640.120.840.090.110.01A0.250.01A0.190.03C组0.500.0965.323.5823.712.3941.6
17、15.890.570.10100.208.9428.841.3919.242.070.660.055.940.490.490.079.201.66302.4071.6411.942.084.830.990.550.181.560.680.100.01A0.190.01A0.170.02P值0.5870.5570.4510.7700.8680.1680.8960.5580.6490.1860.0830.9240.6990.6240.7030.4520.6200.0030.0020.892 2.4 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系的影响2.4.1 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系的OTU分析由表5
18、和图1可知,对照组的OTU数量为1 046个,表4 复合益生菌对绍兴鸭盲肠短链脂肪酸含量的影响(mmol/g)项目乙酸丙酸异丁酸丁酸异戊酸戊酸对照组0.070.01b0.030.0100.020.010.020.01a0A组0.150.06a0.060.0100.040020.010.01b0B组0.080.01b0.040.0200.030.0100C组0.120.02a0.050.0100.040.0100P值0.0200.13600.0850.023063单胃动物2023年第44卷第21期 总第690期P值51015600BacteroidotaFirmicutes*0.014 56*0
19、.024 322025303540455055平均比例(%)注:*表示差异显著(P0.05);下图同。图3 门水平差异菌相对丰度CON组 A组 B组 C组A、B、C组分别为988、971、1 058个;其中对照组特有OTU数量为66个,A组特有OTU数量为65个,B组特有OTU数量为33个,C组特有OUT数量为34个。表5 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系OTU数量的影响组别CONABCOTU数量(个)1 0469889711 058CON组A组B组C组图1 复合益生菌对绍兴鸭盲肠OTU数量韦恩图2.4.2 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系门水平物种分布的影响由图2可知,绍兴鸭盲肠微生物门水平
20、物种组成相对丰度排行前7位的微生物。各组盲肠菌群组成主要由拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门(Actinobacteriota)、脱硫菌门、延叶杆菌门、螺旋藻门等组成。其中差异菌门为拟杆菌门和厚壁菌门。拟杆菌门占整个菌群的比例,对照、A、B、C 组分别为 46.4%、56.9%、47.1%、51.1%;厚壁菌门占整个菌群比例,对照、A、B、C组分别为47.9%、38.2%、40.1%、42.2%。从图3可以看出,与对照组相比,各试验组差异菌门拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度均差异显著(P0.05)。门水平上的相对丰度A组B组C组CON组1.00.80.60.40.20BacteroidotaFirmicu
21、tesActinobacteriotaDesulfobacterotaDeferribacterotaSpirochaetotaothers注:Bacteroidota,拟杆菌门;Firmicutes,厚壁菌门;Actinobacteriota,放线菌门;Desulfobacterota,脱硫菌门;Deferrbacterota,延叶杆菌门;Spirochaetota,螺旋藻门;others,其他;下图同。图2 门水平上物种分布2.4.3 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系属水平物种分布的影响由图4可知,绍兴鸭盲肠微生物属水平物种组成相对丰度排名前34位微生物,其中对照、A、B、C组总和 占 总
22、 菌 属 的 比 例 分 别 是 78.5%、84.2%、79.7%、80.2%,优势菌属拟杆菌属占总菌属比例分别为25.9%、38.2%、40.1%、42.2%。其中差异菌群为瘤胃球菌属和拉氏鳞毛蕨属,从图5可以看出,与对照组相比,各试验组差异菌属瘤胃球菌属和拉氏鳞毛蕨属差异显著(P0.05)。3 讨论3.1 复合益生菌对绍兴鸭生长性能的影响畜禽生长发育状况是畜禽养殖场(户)衡量生产水平和经济效益的重要指标8。李小芬等9研究表64SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期平均比例(%)注:Ruminococcustorquesgroup,瘤胃球菌属;Lachnoclo
23、stridium,拉氏鳞毛蕨属。图5 属水平差异菌群相对丰度P值0.20.40.63.00Ruminococcus_torques_groupLachnoclostridium*0.043 18*0.033 780.81.01.21.41.82.02.22.4CON组 A组 B组 C组2.62.8注:Bacteroides,拟杆菌属;Prevotellaceae_Ga6A1_group,普雷沃氏菌Ga6A1;unclassified_fLachnospiraceae,未分类的毛螺菌属;Prevotella,普氏菌属;Faecalibacterium,粪杆菌属;Rikenellaceac_RC9
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