腹内侧前额叶皮质锥体神经元参与选择性坐骨神经损伤小鼠疼痛和焦虑样行为调控的研究.pdf
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1、中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期腹内侧前额叶皮质锥体神经元参与选择性坐骨神经损伤小鼠疼痛和焦虑样行为调控的研究林培敏1,刘燕1,刘婷2,尹颢霖2,张英1*1.西南医科大学附属中医医院麻醉科;2.西南医科大学,四川泸州646000【摘要】目的探究腹内侧前额叶皮质(ventromedial prefrontal cortex,vmPFC)锥体神经元对选择性坐骨神经损伤(spared nerve injury,SNI)小鼠疼痛和焦虑样行为的调控作用。方法构建SNI神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)动物模型,假手术组(sham)仅暴露神经。向SNI小鼠损伤对
2、侧腹内侧前额叶皮质(ventromedial prefrontal cortex,vmPFC)注射红藻氨酸/生理盐水,或化学遗传学抑制病毒/空载对照病毒。采用von frey纤维丝检测SNI术后损伤侧机械缩足反射阈值(paw withdrawl threshold,PWT);高架十字迷宫评估SNI术后焦虑情况;免疫荧光染色观察SNI损伤对侧vmPFC中c-fos表达及注射红藻氨酸后神经元毁损、星形胶质细胞活化情况,RNA-scope原位杂交染色与免疫荧光染色双标明确Vgat基因和Vglut1基因分别与c-fos的共表达情况。结果术后7 d及14 d,相比于sham小鼠,SNI小鼠损伤侧足底PW
3、T、进入开臂次数和停留时间明显减少(P0.05);SNI小鼠损伤对侧vmPFC中c-fos阳性神经元数量明显增加,c-fos主要表达在Vglut1基因阳性的神经元(P0.05)。相比于损伤对侧vmPFC注射生理盐水的SNI小鼠,注射红藻氨酸的SNI小鼠损伤对侧vmPFC中出现明显的神经元毁损及星形胶质细胞活化现象,损伤侧足底PWT、进入开臂次数和时间明显增加(P0.05)。此外,化学遗传学策略抑制SNI小鼠损伤对侧vmPFC的锥体神经元后,SNI小鼠损伤对侧vmPFC中c-fos阳性神经元数量明显减少,同时损伤侧足底PWT、进入开臂次数和时间明显增加(P0.05)。结论SNI小鼠损伤对侧vmP
4、FC中的锥体神经元影响疼痛及焦虑样行为的发生发展。【关键词】腹内侧前额叶皮质;化学遗传学;锥体神经元;疼痛;焦虑【中图分类号】R338【文献标识码】A【DOI】10.13418/j.issn.1001-165x.2023.5.10The involvements of pyramidal neurons in ventromedial prefrontal cortex in the regulation of pain andanxiety-like behavior of spared nerve injury miceLin Peimin1,Liu Yan1,Liu Ting2,Yin
5、Haoling2,Zhang Ying1*1.Department of Anesthesiology,The Affiliated TCM Hospital of Southwest Medical University,Luzhou646000,Sichuan Province,China;2.Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province,China【Abstract】ObjectiveTo explore the role of pyramidal neurons of ventromedial prefronta
6、l cortex(vmPFC)in pain and anxiety-like behavior of spared nerve injury(SNI)mice.MethodsSpared nerveinjury(SNI)was used to mimic neuropathic pain(NP)animal model,while a same incision without nerveinjury was performed to establish the sham control group.Kainic aicd,normal saline,AAV2/9 virus wereint
7、racranially injected into contralateral vmPFC of SNI mice.Von frey filaments were used to detect the pawwithdraw threshold(PWT)of the ipsilateral planta of SNI mice.The elevated plus maze(EPM)was used toassess anxiety behaviors of SNI mice.Immunofluorescence staining was used to observe the expressi
8、on of c-fos,the neuronal loss and the astrocytic activation in the contralateral vmPFC.RNA-scope andimmunofluorescence staining were used to identify the neuronal type of c-fos positive neuron of vmPFC.ResultsCompared with sham mice,ipsilateral PWT,entries in open arms and cumulative duration in ope
9、narms of SNI mice were significantly decreased at 7d and 14d after SNI(P0.05).Compared with sham mice,c-fos positive neurons were significantly increased in the contralateral of vmPFC of SNI mice(P0.05).Inaddition,the c-fos positive neurons were almost Vglut1 positive neurons.Compared with the SNI m
10、ice whichintracranially injected into contraleral vmPFC with normal saline,ipsilateral PWT,entries in open arms andcumulative duration in open arms of the SNI mice which intracranially injected into contraleral vmPFC withkainic acid were increased(P0.05).Meanwhile,the SNI mice which intracranially i
11、njected into contraleralvmPFC with kainic acid exhibited obvious neuronal loss and astrocytic activation in the contralateral vmPFC.In addition,using chemogenetics strategy to inhibit the pyramidal neurons in contralateral vmPFC of SNImice,the c-fos positive neurons were significantly deceased,the i
12、psilateral PWT,entries in open arms and【收稿日期】2022-03-11【基金项目】四川省科技计划项目-应用基础研究(2021YJ0181)【作者简介】林培敏(1984-),女,硕士,主治医师,研究方向:神经病理性疼痛,E-mail:【通讯作者】张英,教授,硕士研究生导师,E-mail: 实验研究 557CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023cumulative duration in open arms were significantly increased(P0.05).Conclusi
13、onsPyramidal neuronsin the contralateral vmPFC may be involved in the development of pain and anxiety-like behaviors of SNImice.【Key words】Ventromedial prefrontal cortex;Chemogenetics;Pyramidal neuron;Pain;AnxietyCorresponding author:Zhang Ying,E-mail:神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的慢性
14、疼痛,1/3 以上的患者合并有焦虑样负性情绪1,2。焦虑既是NP的并发症,也会促进患者对疼痛的感知3。因此,探索慢性疼痛状态下疼痛、焦虑共病的相关机制具有重要意义。由前边缘皮质和边缘下皮质组成的腹内侧前额叶皮质(ventromedial prefrontal cortex,vmPFC)是调控焦虑的重要脑区4。临床功能影像学研究发现,慢性疼痛状态下患者的 vmPFC 活动性明显增强5。NP 模型大鼠 vmPFC 椎体神经元出现树突数量以及兴奋性均明显增加6。在 vmPFC 中,除极少数-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)能抑制中间神经元外,大部分神经元是谷氨酸能
15、锥体神经元7。近期研究表明,vmPFC 中一氧化氮能锥体神经元参与慢性模型动物焦虑样行为的诱发过程8。然而,vmPFC的锥体神经元对疼痛调控作用需进一步阐明,vmPFC的锥体神经元除调控 NP 的焦虑成分之外,可能还参与痛觉敏化的发生发展,本实验通过红藻氨酸毁损及化学遗传学调控手段明确 vmPFC 的锥体神经元对NP小鼠的疼痛和焦虑样行为的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂与设备兔抗 NeuN 抗体(Abcam,ab177487),鼠抗 GFAP 抗体(Abcam,ab279289),鼠抗c-fos 抗体(Abcam,ab208942),羊抗鼠 Alexa Fluor488 荧 光
16、 二 抗(Abcam,ab150113),羊 抗 兔 AlexaFluor 488 荧 光 二 抗(Abcam,ab150077),羊 抗 鼠Alexa Fluor 555 荧 光 二 抗(Abcam,ab150118),RNAscope 染色试剂盒(Advanced Cell Diagnostics,美国),含 4,6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)抗 荧 光 淬 灭 封 片 剂(碧 云 天,P0131-25mL),红藻氨酸(Abcam,ab120100),氯氮平一氧化氮(clozapine N-oxide,CNO)(枢密
17、科技,CNO-02)。AAV2/9-CaMKIIa-hM4D(Gi)-EYFP(和元生物,AG5047),AAV2/9-CaMKIIa-MCS-3XFLAG-P2A-EGFP-WPRE(和元生物,H4946)。Von frey 纤维丝(上海玉研科学仪器有限公司),小鼠脑立体定位仪(瑞 沃 德,69100),玻 璃 微 电 极 注 射 泵(瑞 沃 德,R480),玻璃微电极显微注射针拉制器(sutter,P97),多 种 型 号 移 液 枪(Eppendorff),-80 冰 箱(ThermoFisher Scientific,Thermo Scientific Forma900),冰冻切片机(
18、徕卡,CM3050 S),荧光显微镜(奥林巴斯,BX51TF)。1.1.2实验动物雄性 C57/6J 小鼠 60 只,体质量 2025 g,812 周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证:SCXK2021-0006,饲养于西南医科大学城北实验动物中心,提供充足的食物及饮用水,温度 2225,每 12 h 进行 1 次昼夜交替,所有操作严格遵循西南医科大学实验动物管理条例。1.2实验方法1.2.1分组设计当前实验分为 3 部分,各部分实验小鼠按照随机数字表法进行随机分配。第 1部分:采用 24 只小鼠,模型组(SNI)16 只、假手术组(sham)8只。其中 SNI组建立右侧 SNI
19、模型,sham组则进行伤口对照,不损伤神经。造模后 1 d、7 d、14 d 检测两组小 鼠 的 右 侧 机 械 缩 足 反 射 阈 值(paw withdrawlthreshold,PWT);造模后 14 d 进行高架十字迷宫实验;SNI 组于造模后 7 d 及 14 d、sham 组于造模后 14d,行为学检测结束后处死小鼠进行脑组织取材,免疫荧光染色观察两组左侧 vmPFC 中神经元活化情况。第 2 部分:选取 12 只小鼠随机分为两组,即红藻氨酸组和对照组,每组6只。红藻氨酸组向左侧vmPFC注射红藻氨酸,而对照组向左侧 vmPFC注射生理盐水。恢复 7 d后,对两组小鼠建立 SNI模
20、型。造模后 14 d,检测两组小鼠的右侧 PWT,并进行高架十字迷宫实验;行为学检测后脑组织取材,观察左侧 vmPFC星形胶质细胞增殖程度及神经元毁损情况。第 3部分:选取18只小鼠随机分为3组,即hM4D+CNO组、hM4D+NS 组、空载+CNO 组,每组 6 只。hM4D+CNO 组及hM4D+NS 组向左侧 vmPFC 注射化学遗传学抑制病毒 AAV2/9-CaMKIIa-hM4D(Gi)-EYFP,而 空 载+CNO组 则 注 射 空 载 对 照 病 毒 AAV2/9-CaMKIIa-MCS-3XFLAG-P2A-EGFP-WPRE。恢复 7 d 后,对 3 组小鼠建立 SNI 模型
21、。造模后 14 d,hM4D+CNO 组及空载+CNO组腹腔注射CNO,而hM4D+NS组腹腔注射生理盐水,30 min后检测右侧PWT;1 h后进行高架十字迷宫实验。1.2.2动物模型制作采用 Decosterd 等9报道的 SNI方法构建小鼠 NP 模型。用 1.5%异氟醚对小鼠进行持续吸入麻醉,待小鼠翻正反射消失、夹尾痛觉消失后,切开右后肢股骨外凹陷处皮肤,钝性分离肌组织,将坐骨神经主干及其 3分支充分暴露。4-0丝线结扎胫神经及腓总神经,保留最细的腓肠神经,并沿结扎点远端剪断胫神经及腓总神经。假手术组(Sham)小 558中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期鼠仅暴露坐
22、骨神经主干及其 3 分支。逐层关闭手术切口,伤口常规涂撒青霉素钠粉末预防感染。1.2.3脑区注射吸入 2%异氟醚诱导麻醉后,将小鼠固定于脑立体定位仪,1.5%异氟醚持续吸入维持麻醉,双眼涂红霉素眼膏。切开头部皮肤,暴露颅骨。去除颅骨表面软组织,充分显露前后囟。颅骨调平,取前囟向前 2.25 mm、旁开 0.3 mm、颅骨表面以下 2.5mm 作为 vmPFC 的坐标点。采用微量注射泵进行注射,第 2 部分实验中向左侧 vmPFC 注射红藻氨酸(kainic acid)(200 nL,1 mg/mL)或生理盐水 200 nL,第 3 部分实验中向左侧 vmPFC 注射化学遗传学抑制病 毒(AAV
23、2/9-CaMKIIa-hM4D(Gi)-EYFP)(100 nL,21012)或 空 载 对 照 病 毒(AAV 2/9-CaMKIIa-MCS-3XFLAG-P2A-EGFP-WPRE)(100 nL,21012),注射速度为 60 nL/min,注射完毕留针 10 min,缓慢拔出。碘伏消毒颅骨表面及头皮伤口,将小鼠置于保温毯下待其苏醒,单笼喂养。1.2.4行为学检测足底机械痛检测:小鼠预先在底部为0.5 cm孔径铁丝网的透明玻璃箱(20 cm20 cm20 cm)适应 30 min,用 Von frey 纤维丝垂直刺向小鼠右足底皮肤,刺激强度为 0.022 g。从 0.4 g 开始,持
24、续刺向足底 4 s,阳性反应为小鼠出现缩足或舔足动作,记录出现阳性反应的强度。共测量 3 次,间隔 5min,取3次平均值作为所测得PWT。高架十字迷宫(the elevated plus maze,EPM):将高架十字迷宫放置于 VisuTrack动物行为分析系统的摄像头中央,喷洒 70%酒精去除异味,调整照射光源的光强约为 30 lux,小鼠提前 30 min 置于行为学检测房间适应环境。计算开臂以及闭臂的距离,选择观察区,定义开臂、闭臂、中心区,检测时间设置为 6 min。将小鼠轻柔放置于中心区,开始检测。计算小鼠进入开臂次数和开臂停留时间。1.2.5免疫荧光染色及细胞计数小鼠采用 PB
25、S(1020 mL)进行心灌注,待肝变白后继续用 4%多聚甲醛固定液(510 mL)灌注。快速取出整个脑组织,4%多聚甲醛固定 24 h。依次在 20%、30%蔗糖溶液中脱水至沉底。脑组织预处理结束后,进行冰冻切片,切片厚 40 m。脑片用 PBS 清洗后,含 0.3%tritonX 的10%山羊血清室温封闭 30 min。PBS 洗涤后,4 孵育 一 抗:NeuN(1:1000),GFAP(1:200),c-fos(1:500),孵 育 812 h。PBS 清 洗 后,室 温 孵 育 AlexaFluor 488 或 Alexa Fluor 555 荧光二抗(1:1000),孵育 1 h。将
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