二甲双胍通过AMPK_PPAR-γ通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用.pdf
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1、张紫微,2017 年博士毕业于昆明医科大学。现就职于云南省阜外心血管病医院冠心病中心,副主任医师,现为冠脉介入培训基地导师,中国老年医学学会心血管病分会青年委员,云南省医学会激光分会委员。擅长左主干病变、慢性闭塞病变,钙化病变等复杂冠心病介入治疗。熟练掌握冠状动脉旋磨术、准分子激光销蚀、冲击波球囊,左主干分叉病变、正、逆向及 ADR 开通慢性闭塞病变。主持云南省科研基金项目 1 项,第 1 作者发表 SCI 论文 2 篇,北大核心期刊论文 10 余篇。二甲双胍通过 AMPK/PPAR-通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用张紫微1),郑甲林1),许晓宇1,2),王红1)(1)云南省阜外
2、心血管病医院冠心病中心,云南 昆明650032;2)昆明医科大学研究生院,云南 昆明650500)摘要 目的探讨二甲双胍(Metformin)对高糖培养的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecell,VSMCs)自噬、细胞增殖的影响及其调控机制。方法用 Western blot 检测不同处理组微管相关蛋白轻链-3-(LC3-),Becline-1 蛋白水平变化,透射电镜观察各处理组 VSMCs 自噬小体水平;用 Western blot 检测不同处理组 p-AMPK/AMPK、PPAR-蛋白表达水平;用 EDU 法检测不同处理组 VSMCs 增殖情况。结果二甲
3、双胍、雷帕霉素逆转高糖抑制 VSMCs 自噬的作用(P 0.001);Compound C、GW9662 增加高糖抑制 VSMCs自噬的作用(P 0.05);二甲双胍逆转高糖对 AMPK/PPAR-通路的负调控(P 0.01);二甲双胍、雷帕霉素抑制高糖促进的 VSMCs 增殖(P 0.001),Compound C、GW9662 逆转二甲双胍抑制高糖促 VSMCs 增殖的作用(P 0.05)。结论高糖促进 VSMCs 增殖可能是自噬调节相关的,二甲双胍可通过激活 AMPK/PPAR-通路上调VSMCs 自噬水平,抑制高糖促进的 VSMCs 异常增殖。关键词二甲双胍;高糖;自噬;血管平滑肌细胞
4、;增殖中图分类号 R54 文献标志码 A 文章编号 2095 610X(2023)10 0060 07Metformin Inhibits high Glucose-induced Vascular SmoothMuscle Cells Proliferation by Promoting Autophagy viaAMPK/PPAR-ZHANG Ziwei1),ZHENG Jialin1),XU Xiaoyu1,2),WANG Hong1)(1)Center of Coronary Heart Disease,Fuwai Yunnan Cardiovascular Hospital,Kunm
5、ing Yunnan 650032,China;2)Graduate School of Kunming Medical University,Kunming Yunnan 650500,China)Abstract ObjectiveTo investigate the effect and regulatory mechanism of metformin on autophagy andcell proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)cultured in high glucose in mice aortic.Metho
6、dsWes-tern blot was used to detect the changes in microtubule-associated protein light chain 3-II(LC3-II)and Beclin-1收稿日期20230823基金项目云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目(81170250);云南省医学创新团队基金资助项目(202005AE160020)作者简介张紫微(1985),男,江西九江人,医学博士,副主任医师,主要从事冠心病基础研究与介入诊疗工作。通信作者王红,E-mail:昆明医科大学学报2023,44(10):6066Journa
7、lofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20231026CN531221/Rprotein levels in different treatment groups.Transmission electron microscope was used to observe the the level ofautophagosomes in VSMCs of each treatment group.Western blot was used to detect the expression levels of p-AMP
8、K/AMPK and PPAR-proteins in different treatment groups.The EDU method was used to detect theproliferation of VSMCs in different treatment groups.ResultsMetformin and rapamycin reversed the inhibitoryeffect of high glucose on VSMC autophagy(P 0.001).Compound C and GW9662 enhanced the inhibitory effec
9、t ofhigh glucose on VSMC autophagy(P 0.05).Metformin reversed the negative regulation of high glucose on theAMPK/PPAR-pathway(P 0.01).Metformin and rapamycin inhibited high glucose-induced VSMC proliferation(P 0.001),and Compound C and GW9662 reversed the inhibitory effect of metformin on high gluco
10、se-inducedVSMC proliferation(P 0.05).ConclusionHigh glucose promotes the proliferation of VSMCs,which may beregulated by autophagy.Metformin can upregulate autophagy levels in VSMCs by activating the AMPK/PPAR-pathway,thereby inhibiting the abnormal proliferation of VSMCs induced by high sugar.Key w
11、ords Metformin;High glucose;Autophagy;Vascular smooth muscle cell;Proliferation糖尿病显著增加了心血管疾病的发病率和病死率,深入研究糖尿病合并冠心病的分子机制并在此基础上寻找新的治疗靶点,对防治糖尿病合并血管病变具有重要的意义。糖尿病高糖环境下血 管 平 滑 肌 细 胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)的异常增殖、迁移及表型转换等1-2,可促进高血压、脑卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脑血管疾病的发生发展。高血糖是最常见的糖尿病合并慢性血管并发症的危险因素之一,其能通过多种机制影
12、响动脉硬化的进展。自噬即细胞对自身的吞噬作用,指细胞通过形成自噬溶酶体消化自身大分子蛋白及细胞器的降解过程,从而维持细胞稳态3。有证据显示自噬可参与多种因素引起的 VSMCs 增殖4、细胞表型转换5、细胞内钙离子浓度调节6,炎性反应、脂质沉积7等活动,从而参与动脉硬化的发生发展。目前有关高糖环境下对血管平滑肌细胞自噬的调节以及自噬如何参与调节 VSMCs 生物功能学的报道甚少。二甲双胍(Metformin)是临床上常用降糖药,除了降糖作用以外,其还具有调节血脂、抗炎等多重广泛机制抗动脉粥样硬化的作用8-9,其中,二甲双胍通过调节细胞自噬抗动脉粥样硬化的作用也越来越受到重视,如其可通过促进 Kr
13、ueppel样因子 2(krueppel-like factor 2,KLF2)介导的自噬抑制泡沫细胞的形成10,还可通过调节 Runt 相关 转 录 因 子 2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的自噬降解抑制血管钙化起到抗动脉硬化作用11。本文以小鼠血管平滑肌细胞为研究对象,观察自噬是否参与高糖促进 VSMCs 的增殖,二甲双胍能否通过干预自噬影响高糖促进 VSMCs 增殖作用,进一步探讨自噬在高糖对 VSMCs 的作用及可能治疗方向,为临床糖尿病心血管并发症的防治提供新的手段及依据。1材料与方法1.1实验材料小鼠主动脉平滑肌细胞(北纳生物
14、,批号:BNCC338213),高糖型 DMEM 培养基(葡萄糖浓度 25 mmol/L)、低糖型 DMEM 培养基(葡萄糖浓度 5.6 mmol/L)(HyClone,USA),15%胎牛血清(Gibco,USA),0.25%EDTA 胰蛋白酶(Sigma,USA),PVDF 膜(广锐生物,中国),细胞裂解液(碧云天生物,中国),EDU 检测试剂盒(碧云天生物,C0078S),单克隆抗体:LC3B 单抗(Abcam,ab51520),Becline-1(Proteintech,USA),p-AMPK/AMPK(Proteintech,USA),PPAR-(Proteintech,USA),-
15、actin(Proteintech,USA),二 甲 双 胍(Medchemexpress,USA),雷帕霉素(Sigma,USA),Compound C(Abcam,USA),GW9662(Abcam,USA),二抗 IgG-HRP(碧云天生物,中国),BCA法蛋白定量检测试剂盒(碧云天生物,中国),ECL 显色试剂盒(碧云天生物,中国)。1.2实验方法1.2.1VSMCs 培养及分组将小鼠主动脉血管平滑肌细胞重悬于 15%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12 完全培养基中。轻柔操作重悬细胞,转入 25 cm2 细胞培养瓶中,置于 37、5%CO2培养箱中进行培养,23 d 更换 1 次培养
16、液,细胞融合至 80%90%用 0.25%胰蛋白酶消化传代,按 1214 比例传代,共传 35 代,选处于对数生长期的的细胞分为不同处理组进行相应处理。1.2.2细胞增殖实验EDU 染色法检测小鼠血管平滑肌细胞增殖,接种细胞于 24 孔板培养 24 h并同步化细胞,按不同处理分为 8 组:对照组、第 10 期张紫微,等二甲双胍通过 AMPK/PPAR-通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用61高糖组、二甲双胍组、高糖+二甲双胍组、高糖+雷帕霉素组、高糖+二甲双胍组+Compound C 组、高糖+二甲双胍组+GW9662 组、高糖+二甲双胍组+雷帕霉素组。二甲双胍浓度为 10 mmol
17、/L,作用 24 h,雷帕霉素浓度为 100 nmol/L,CompoundC 浓度为 10 mol/L,GW9662 浓度为 10 mol/L,作用 24 h。按 10001 的比例稀释 EDU 溶液,细胞干预结束后加入 200 L 浓度10 mol/L 的 EDU培养液孵育 2 h 时,余按 EdU 细胞增殖检测试剂盒说明书继续操作,荧光显微镜下每组随机选 5个视野拍照观察。1.2.3Western blot 检测蛋白表达Western blot检测 LC3-/LC3-I、Becline-1、p-AMPK/AMPK、PPAR-蛋白表达,将各组细胞分别处理,每个处理组 3 个样本,加入 10
18、0 L RIPA 裂解液,30 min;4,12,000 r/min 离心 5 min;取上清,BCA 法定量检测蛋白,取等量蛋白于 10%SDS-PAGE 进行电泳分离、转膜。5%的脱脂奶粉室温下摇床封闭,加入一抗以 11000 稀释,4 孵育过夜;加入二抗 15000 稀释,室温孵育 2 h,漂洗,配制 ECL 显影剂于凝胶显影仪上曝光显影,用 Bio-Rad Quantity One 软件定量分析。1.2.4透射电子显微镜观察不同处理组细胞自噬体收集对照组、高糖组、高糖+二甲双胍组血管平滑肌细胞,使用 2.5%戊二醛在 4 过夜,然后用 ddH2O 漂洗,锇酸固定 1 h,乙醇及丙酮梯度
19、脱水;再经渗透、树脂包埋、聚合后,制备70 nm 厚度的切片;使用醋酸铀-柠檬酸铅染色,MORADA G2 电镜下观察 3 组平滑肌细胞自噬小体的数量并摄片。1.3统计学处理 xs用 SPSS 13.0 进行统计分析,计量资料以均数标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采取 Tukey 法,P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1二甲双胍、雷帕霉素逆转高糖抑制 VSMCs自噬的作用将小鼠 VSMCs 分为对照组(5.6 mmol/L 葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L 葡萄糖)、高糖+二甲双胍(10 mmol/L)、高糖+雷帕霉素(100 nmol/L)四组,观察不
20、同组 VSMCs 自噬蛋白表达情况,结果显示高糖培养下 VSMCs LC3-/LC3-I、Becline-1 蛋白较对照组表达水平降低(P 0.001),提示高糖培养抑制 VSMCs 自噬水平,而二甲双胍及自噬促进剂雷帕霉素可促进高糖培养下的 VSMCsLC3-/LC3-I、Becline-1 表达水平升高(P 0.001),提示二甲双胍、雷帕霉素可作为自噬诱导剂,促进 VSMCs 发生自噬,并逆转高糖抑制 VSMCs 自噬的作用。电镜显示高糖培养下 VSMCs 自噬小体计数较对照组降低,而二甲双胍可显著增加高糖培养下 VSMCs 自噬小体的数量,证实二甲双胍可逆转高糖培养的 VSMCs 受抑
21、制的自噬,见图 1。2.2AMPK、PPAR-抑 制 剂 增 加 高 糖 抑 制VSMCs 自噬的作用将小鼠 VSMCs 分为对照组、高糖组、AMPK抑制剂 Compound C(10 mol/L)+高糖组,PPAR-抑制剂 GW9662(10 mol/L)+高糖组共 4 个处理 组,用 Western blot 检 测 自 噬 蛋 白 LC3 及Becline-1 表达水平,Western Blot 结果显高糖抑制 VSMCs LC3-/LC3-、Becline-1 表达(P 0.001),而 AMPK 抑制剂、PPAR-抑制剂可进一步抑制高糖培养下 VSMCs 相关自噬蛋白的表达(P 0.
22、05),见图 2。2.3二甲双胍逆转高糖对 AMPK/PPAR-通路的负调控将小鼠 VSMCs 分为对照组、高糖组、MET+高糖组,Compound C+高糖组 4 个处理组,检测不同组 p-AMPK/AMPK 表达情况,结果显高糖抑制 VSMCs p-AMPK/AMPK 表达(P 0.001),二甲双胍可逆转高糖抑制 AMPK 通路激活(P 0.001),而使用 AMPK 抑制剂后进一步增强高糖抑制AMPK 通 路 激 活 的 作 用(P 0.01)。用 高 糖、MET+高糖,GW9662+高糖预处理,检测不同组PPAR-表达情况,结果显高糖抑制 VSMCsPPAR-表达(P 0.001),
23、二甲双胍可逆转其作用(P 0.01),而使用 PPAR-抑制剂后进一步增强高糖抑制 PPAR-表达的作用(P 0.05),见图 3。2.4二甲双胍抑制高糖促进的 VSMCs 增殖将小鼠 VSMCs 分为对照组、高糖组、二甲双胍组、高糖+二甲双胍组、高糖+雷帕霉素组、高糖+二甲双胍组+Compound C 组、高糖+二甲双胍组+GW9662 组、高糖+二甲双胍组+雷帕霉素组 8个处理组,EDU 染色细胞检测不同组细胞增殖情况,结果显示高糖促进 VSMCs 增殖(P 0.05),MET 及 RAP 抑制高糖促进的 VSMCs 增殖作用,且 MET 可 进 一 步 增 强 RAP 抑 制 高 糖 促
24、 进 的VSMCs 增殖作用(P 0.001)。而使用 AMPK 抑制剂 Compound C 及 PPAR-抑制剂 GW9662 后可逆转 MET 抑制 HG 促进 VSMCs 增殖的作用(P 62昆明医科大学学报第 44 卷X3000X12000X12000X3000X3000X12000CtrlLC3-ILC3-IIBeclin1-actinHGHG+METHG+RAPCtrlHGHG+METHG+RAP0.08ABCDLC3-II/I0.06*0.04Protein level0.020CrtlHGHG+METHG+RAP2.0Beclin11.5*1.0Protein level0.
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