二甲双胍通过AMPK_PPAR-γ通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用.pdf

张紫微，2017 年博士毕业于昆明医科大学。现就职于云南省阜外心血管病医院冠心病中心，副主任医师，现为冠脉介入培训基地导师，中国老年医学学会心血管病分会青年委员，云南省医学会激光分会委员。擅长左主干病变、慢性闭塞病变，钙化病变等复杂冠心病介入治疗。熟练掌握冠状动脉旋磨术、准分子激光销蚀、冲击波球囊，左主干分叉病变、正、逆向及 ADR 开通慢性闭塞病变。主持云南省科研基金项目 1 项，第 1 作者发表 SCI 论文 2 篇，北大核心期刊论文 10 余篇。二甲双胍通过 AMPK/PPAR-通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用张紫微1），郑甲林1），许晓宇1,2），王红1）（1）云南省阜外心血管病医院冠心病中心，云南 昆明650032;2）昆明医科大学研究生院，云南 昆明650500）摘要 目的探讨二甲双胍（Metformin）对高糖培养的小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth musclecell，VSMCs）自噬、细胞增殖的影响及其调控机制。方法用 Western blot 检测不同处理组微管相关蛋白轻链-3-（LC3-），Becline-1 蛋白水平变化，透射电镜观察各处理组 VSMCs 自噬小体水平；用 Western blot 检测不同处理组 p-AMPK/AMPK、PPAR-蛋白表达水平；用 EDU 法检测不同处理组 VSMCs 增殖情况。结果二甲双胍、雷帕霉素逆转高糖抑制 VSMCs 自噬的作用（P 0.001）；Compound C、GW9662 增加高糖抑制 VSMCs自噬的作用（P 0.05）；二甲双胍逆转高糖对 AMPK/PPAR-通路的负调控（P 0.01）；二甲双胍、雷帕霉素抑制高糖促进的 VSMCs 增殖（P 0.001），Compound C、GW9662 逆转二甲双胍抑制高糖促 VSMCs 增殖的作用（P 0.05）。结论高糖促进 VSMCs 增殖可能是自噬调节相关的，二甲双胍可通过激活 AMPK/PPAR-通路上调VSMCs 自噬水平，抑制高糖促进的 VSMCs 异常增殖。关键词二甲双胍；高糖；自噬；血管平滑肌细胞；增殖中图分类号 R54 文献标志码 A 文章编号 2095 610X（2023）10 0060 07Metformin Inhibits high Glucose-induced Vascular SmoothMuscle Cells Proliferation by Promoting Autophagy viaAMPK/PPAR-ZHANG Ziwei1），ZHENG Jialin1），XU Xiaoyu1,2），WANG Hong1）（1）Center of Coronary Heart Disease，Fuwai Yunnan Cardiovascular Hospital，Kunming Yunnan 650032，China;2）Graduate School of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650500，China）Abstract ObjectiveTo investigate the effect and regulatory mechanism of metformin on autophagy andcell proliferation of vascular smooth muscle cells（VSMCs）cultured in high glucose in mice aortic.MethodsWes-tern blot was used to detect the changes in microtubule-associated protein light chain 3-II（LC3-II）and Beclin-1收稿日期20230823基金项目云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目（81170250）；云南省医学创新团队基金资助项目（202005AE160020）作者简介张紫微（1985），男，江西九江人，医学博士，副主任医师，主要从事冠心病基础研究与介入诊疗工作。通信作者王红，E-mail：昆明医科大学学报2023，44（10）：6066JournalofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20231026CN531221/Rprotein levels in different treatment groups.Transmission electron microscope was used to observe the the level ofautophagosomes in VSMCs of each treatment group.Western blot was used to detect the expression levels of p-AMPK/AMPK and PPAR-proteins in different treatment groups.The EDU method was used to detect theproliferation of VSMCs in different treatment groups.ResultsMetformin and rapamycin reversed the inhibitoryeffect of high glucose on VSMC autophagy（P 0.001）.Compound C and GW9662 enhanced the inhibitory effect ofhigh glucose on VSMC autophagy（P 0.05）.Metformin reversed the negative regulation of high glucose on theAMPK/PPAR-pathway（P 0.01）.Metformin and rapamycin inhibited high glucose-induced VSMC proliferation（P 0.001），and Compound C and GW9662 reversed the inhibitory effect of metformin on high glucose-inducedVSMC proliferation（P 0.05）.ConclusionHigh glucose promotes the proliferation of VSMCs，which may beregulated by autophagy.Metformin can upregulate autophagy levels in VSMCs by activating the AMPK/PPAR-pathway，thereby inhibiting the abnormal proliferation of VSMCs induced by high sugar.Key words Metformin；High glucose；Autophagy；Vascular smooth muscle cell；Proliferation糖尿病显著增加了心血管疾病的发病率和病死率，深入研究糖尿病合并冠心病的分子机制并在此基础上寻找新的治疗靶点，对防治糖尿病合并血管病变具有重要的意义。糖尿病高糖环境下血 管 平 滑 肌 细 胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）的异常增殖、迁移及表型转换等1-2，可促进高血压、脑卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脑血管疾病的发生发展。高血糖是最常见的糖尿病合并慢性血管并发症的危险因素之一，其能通过多种机制影响动脉硬化的进展。自噬即细胞对自身的吞噬作用，指细胞通过形成自噬溶酶体消化自身大分子蛋白及细胞器的降解过程，从而维持细胞稳态3。有证据显示自噬可参与多种因素引起的 VSMCs 增殖4、细胞表型转换5、细胞内钙离子浓度调节6，炎性反应、脂质沉积7等活动，从而参与动脉硬化的发生发展。目前有关高糖环境下对血管平滑肌细胞自噬的调节以及自噬如何参与调节 VSMCs 生物功能学的报道甚少。二甲双胍（Metformin）是临床上常用降糖药，除了降糖作用以外，其还具有调节血脂、抗炎等多重广泛机制抗动脉粥样硬化的作用8-9，其中，二甲双胍通过调节细胞自噬抗动脉粥样硬化的作用也越来越受到重视，如其可通过促进 Krueppel样因子 2（krueppel-like factor 2，KLF2）介导的自噬抑制泡沫细胞的形成10，还可通过调节 Runt 相关 转 录 因 子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）的自噬降解抑制血管钙化起到抗动脉硬化作用11。本文以小鼠血管平滑肌细胞为研究对象，观察自噬是否参与高糖促进 VSMCs 的增殖，二甲双胍能否通过干预自噬影响高糖促进 VSMCs 增殖作用，进一步探讨自噬在高糖对 VSMCs 的作用及可能治疗方向，为临床糖尿病心血管并发症的防治提供新的手段及依据。1材料与方法1.1实验材料小鼠主动脉平滑肌细胞（北纳生物，批号：BNCC338213），高糖型 DMEM 培养基（葡萄糖浓度 25 mmol/L）、低糖型 DMEM 培养基（葡萄糖浓度 5.6 mmol/L）（HyClone，USA），15%胎牛血清（Gibco，USA），0.25%EDTA 胰蛋白酶（Sigma，USA），PVDF 膜（广锐生物，中国），细胞裂解液（碧云天生物，中国），EDU 检测试剂盒（碧云天生物，C0078S），单克隆抗体：LC3B 单抗（Abcam，ab51520），Becline-1（Proteintech，USA），p-AMPK/AMPK（Proteintech，USA），PPAR-（Proteintech，USA），-actin（Proteintech，USA），二 甲 双 胍（Medchemexpress，USA），雷帕霉素（Sigma，USA），Compound C（Abcam，USA），GW9662（Abcam，USA），二抗 IgG-HRP（碧云天生物，中国），BCA法蛋白定量检测试剂盒（碧云天生物，中国），ECL 显色试剂盒（碧云天生物，中国）。1.2实验方法1.2.1VSMCs 培养及分组将小鼠主动脉血管平滑肌细胞重悬于 15%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12 完全培养基中。轻柔操作重悬细胞，转入 25 cm2 细胞培养瓶中，置于 37、5%CO2培养箱中进行培养，23 d 更换 1 次培养液，细胞融合至 80%90%用 0.25%胰蛋白酶消化传代，按 1214 比例传代，共传 35 代，选处于对数生长期的的细胞分为不同处理组进行相应处理。1.2.2细胞增殖实验EDU 染色法检测小鼠血管平滑肌细胞增殖，接种细胞于 24 孔板培养 24 h并同步化细胞，按不同处理分为 8 组：对照组、第 10 期张紫微，等二甲双胍通过 AMPK/PPAR-通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用61高糖组、二甲双胍组、高糖+二甲双胍组、高糖+雷帕霉素组、高糖+二甲双胍组+Compound C 组、高糖+二甲双胍组+GW9662 组、高糖+二甲双胍组+雷帕霉素组。二甲双胍浓度为 10 mmol/L，作用 24 h，雷帕霉素浓度为 100 nmol/L，CompoundC 浓度为 10 mol/L，GW9662 浓度为 10 mol/L，作用 24 h。按 10001 的比例稀释 EDU 溶液，细胞干预结束后加入 200 L 浓度10 mol/L 的 EDU培养液孵育 2 h 时，余按 EdU 细胞增殖检测试剂盒说明书继续操作，荧光显微镜下每组随机选 5个视野拍照观察。1.2.3Western blot 检测蛋白表达Western blot检测 LC3-/LC3-I、Becline-1、p-AMPK/AMPK、PPAR-蛋白表达，将各组细胞分别处理，每个处理组 3 个样本，加入 100 L RIPA 裂解液，30 min；4，12，000 r/min 离心 5 min；取上清，BCA 法定量检测蛋白，取等量蛋白于 10%SDS-PAGE 进行电泳分离、转膜。5%的脱脂奶粉室温下摇床封闭，加入一抗以 11000 稀释，4 孵育过夜；加入二抗 15000 稀释，室温孵育 2 h，漂洗，配制 ECL 显影剂于凝胶显影仪上曝光显影，用 Bio-Rad Quantity One 软件定量分析。1.2.4透射电子显微镜观察不同处理组细胞自噬体收集对照组、高糖组、高糖+二甲双胍组血管平滑肌细胞，使用 2.5%戊二醛在 4 过夜，然后用 ddH2O 漂洗，锇酸固定 1 h，乙醇及丙酮梯度脱水；再经渗透、树脂包埋、聚合后，制备70 nm 厚度的切片；使用醋酸铀-柠檬酸铅染色，MORADA G2 电镜下观察 3 组平滑肌细胞自噬小体的数量并摄片。1.3统计学处理 xs用 SPSS 13.0 进行统计分析，计量资料以均数标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采取 Tukey 法，P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1二甲双胍、雷帕霉素逆转高糖抑制 VSMCs自噬的作用将小鼠 VSMCs 分为对照组（5.6 mmol/L 葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L 葡萄糖）、高糖+二甲双胍（10 mmol/L）、高糖+雷帕霉素（100 nmol/L）四组，观察不同组 VSMCs 自噬蛋白表达情况，结果显示高糖培养下 VSMCs LC3-/LC3-I、Becline-1 蛋白较对照组表达水平降低（P 0.001），提示高糖培养抑制 VSMCs 自噬水平，而二甲双胍及自噬促进剂雷帕霉素可促进高糖培养下的 VSMCsLC3-/LC3-I、Becline-1 表达水平升高（P 0.001），提示二甲双胍、雷帕霉素可作为自噬诱导剂，促进 VSMCs 发生自噬，并逆转高糖抑制 VSMCs 自噬的作用。电镜显示高糖培养下 VSMCs 自噬小体计数较对照组降低，而二甲双胍可显著增加高糖培养下 VSMCs 自噬小体的数量，证实二甲双胍可逆转高糖培养的 VSMCs 受抑制的自噬，见图 1。2.2AMPK、PPAR-抑 制 剂 增 加 高 糖 抑 制VSMCs 自噬的作用将小鼠 VSMCs 分为对照组、高糖组、AMPK抑制剂 Compound C（10 mol/L）+高糖组，PPAR-抑制剂 GW9662（10 mol/L）+高糖组共 4 个处理 组，用 Western blot 检 测 自 噬 蛋 白 LC3 及Becline-1 表达水平，Western Blot 结果显高糖抑制 VSMCs LC3-/LC3-、Becline-1 表达（P 0.001），而 AMPK 抑制剂、PPAR-抑制剂可进一步抑制高糖培养下 VSMCs 相关自噬蛋白的表达（P 0.05），见图 2。2.3二甲双胍逆转高糖对 AMPK/PPAR-通路的负调控将小鼠 VSMCs 分为对照组、高糖组、MET+高糖组，Compound C+高糖组 4 个处理组，检测不同组 p-AMPK/AMPK 表达情况，结果显高糖抑制 VSMCs p-AMPK/AMPK 表达（P 0.001），二甲双胍可逆转高糖抑制 AMPK 通路激活（P 0.001），而使用 AMPK 抑制剂后进一步增强高糖抑制AMPK 通 路 激 活 的 作 用（P 0.01）。用 高 糖、MET+高糖，GW9662+高糖预处理，检测不同组PPAR-表达情况，结果显高糖抑制 VSMCsPPAR-表达（P 0.001），二甲双胍可逆转其作用（P 0.01），而使用 PPAR-抑制剂后进一步增强高糖抑制 PPAR-表达的作用（P 0.05），见图 3。2.4二甲双胍抑制高糖促进的 VSMCs 增殖将小鼠 VSMCs 分为对照组、高糖组、二甲双胍组、高糖+二甲双胍组、高糖+雷帕霉素组、高糖+二甲双胍组+Compound C 组、高糖+二甲双胍组+GW9662 组、高糖+二甲双胍组+雷帕霉素组 8个处理组，EDU 染色细胞检测不同组细胞增殖情况，结果显示高糖促进 VSMCs 增殖（P 0.05），MET 及 RAP 抑制高糖促进的 VSMCs 增殖作用，且 MET 可 进 一 步 增 强 RAP 抑 制 高 糖 促 进 的VSMCs 增殖作用（P 0.001）。而使用 AMPK 抑制剂 Compound C 及 PPAR-抑制剂 GW9662 后可逆转 MET 抑制 HG 促进 VSMCs 增殖的作用（P 62昆明医科大学学报第 44 卷X3000X12000X12000X3000X3000X12000CtrlLC3-ILC3-IIBeclin1-actinHGHG+METHG+RAPCtrlHGHG+METHG+RAP0.08ABCDLC3-II/I0.06*0.04Protein level0.020CrtlHGHG+METHG+RAP2.0Beclin11.5*1.0Protein level0.501510*5Number of autophagosome0CrtlHGHG+MET图1二甲双胍对高糖培养下的 VSMCs 自噬水平的影响Fig.1EffectofmetforinonautophagyinHG-culturedVSMCsA：Western blot 检测对照组、HG 组、HG+MET 组及 HG+RAP 组 LC3-/LC3-、Becline-1 的表达情况；B：定量分析不同处理组 LC3-/LC3-的表达水平；C：定量分析不同处理组 Becline-1 蛋白的表达水平；D：电镜检测对照组、HG 组、MET+HG 组自噬小体（12000）（黑色箭头示自噬小体）。*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。CtrlLC3-ILC3-IIBeclin1-actin0.05LC3-II/I0.040.030.02Protein level0.010CtrlHG*HG+CCHG+GWHGHG+CCHG+GWABC2.0Beclin11.51.0Protein level0.50CrtlHG*HG+CCHG+GW图2AMPK、PPAR-抑制剂对 VSMCs 自噬的影响Fig.2EffectofAMPKorPPAR-inhibitoronautophagyinVSMCsA：Western blot 检测对照组、HG 组、HG+CC 组及 HG+GW 组 LC3-/LC3-、Becline-1 的表达情况；B：定量分析不同处理组 LC3-/LC3-的表达水平；C：定量分析不同处理组 Becline-1 的表达水平。*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。第 10 期张紫微，等二甲双胍通过 AMPK/PPAR-通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用630.05），见图 4。3讨论高血糖是最常见的糖尿病合并慢性血管并发症的危险因素之一，能通过多种机制影响动脉硬化的进展，如可能促进糖基化终末产物的形成，进一步促进炎症反应诱发 VSMCs 增殖1213，脂质代谢紊乱14，影响各种生长因子的分泌及表达，氧化应激等15。多项研究发现高糖还可通过调节自噬参与多种心血管疾病病理生理。如 Liu 等16报道高糖可通过AMPK 通路介导血管内皮细胞自噬促进其凋亡，而 Xu 等17报道高糖抑制心肌细胞自噬并促进其凋亡，可能导致糖尿病心肌疾病的发生。研究证实 VSMCs 的自噬可通过多种形式参与动脉粥样硬化的进程发展，本课题组前期工作也发现自噬参与血管紧张素 II 诱导的 VSMCs细胞表型转换5，但高糖是否通过自噬参与VSMCs 增殖及其相关机制尚不明确。二甲双胍作为目前临床最常用的降糖用药之一，既往研究显示其还有改善内皮功能18、改善胰岛素抵抗19，减少平滑肌细胞向泡沫细胞转换20，抗氧化应激等21抗动脉粥样硬化作用。近年来有研究显示二甲双胍通过调节自噬抗动脉粥样硬化，如其可通过调节长链非编码 RNA 牛磺酸上调基因 1 诱导自噬，抑制血管壁细胞增殖从而起到抗动脉粥样硬化作用22，还可通过上调Kruppel 样因子 2 介导的自噬抑制 APOE 基因敲除的小鼠动脉硬化进程及斑块易损性10。本研究通过检测 LC3、Becline-1 等自噬相关蛋白及电镜检测自噬小体等方法发现高糖培养显著抑制 VSMCs自噬水平，使用二甲双胍、自噬诱导剂雷帕霉素促进自噬水平并抑制高糖诱导的 VSMCs 增殖，笔者推测高糖培养可通过抑制自噬调控促进 VSMCs增殖。与自噬激动剂雷帕霉素一样，二甲双胍亦可通过促进自噬并抑制高糖培养的 VSMCs 增殖。本研究还发现雷帕霉素促进自噬并抑制高糖促进VSMCs 增殖的作用，二甲双胍联合雷帕霉素可进一步增强其抑制 VSMCs 增殖的作用，见图 4，提示不同机制自噬激活剂的联合可进一步增强抑制高糖促 VSMCs 增殖的作用。AMPK/PPAR-通路广泛参与细胞代谢和糖代谢过程，也参与调节自噬2324，本研究证实高糖环境下可抑制 VSMCs AMPK/PPAR-通路的激活，二甲双胍则可激活 APMK/PPAR-通路，并逆转高糖抑制 AMPK/PPAR-通路的作用。是否 AMPK/PPAR-通路参与高糖抑制的 VSMCs自噬，为进一步证实自噬参与二甲双胍抑制的VSMCs 增殖并探究其机制，笔者使用 PPAR-抑制剂 GW9662 及 AMPK 抑制剂 Compound C 后发现其可进一步增强高糖抑制 VSMCs 自噬的作用，见图 2，并削弱二甲双胍抑制细胞增殖的作用，提示自噬可能参与高糖诱导的 VSMCs 增殖，高糖可能通过抑制 AMPK/PPAR-通路抑制 VSMCsACBDCtrl-actinAMPKp-AMPKHGHG+METHG+CC0.020*0.0150.010Protein level0.0050CKHGHG+METp-AMPK/AMPKHG+CC2.5*2.01.5Protein level0.50CrtlHGHG+METPPAR-actinCtrlHGHG+METHG+GWPPAR-HG+GW1.0图3二甲双胍对高糖培养下 VSMCs p-AMPK/AMPK、PPAR-表达的影响Fig.3Effectofmetforminandhighglucoseonp-AMPK/AMPK、PPAR-expressionofVSMCsA：Western blot 检测对照组、HG 组、HG+MET 组及 HG+CC 组 p-AMPK/AMPK 的表达；B：定量分析不同处理组 p-AMPK/AMPK 的表达水平；C：Western blot 检测对照组、HG 组、HG+MET 组及 HG+GW 组 PPAR-的表达；D：定量分析不同处理组 PPAR-的表达水平。*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。64昆明医科大学学报第 44 卷自噬，从而进一步促进 VSMCs 增殖，这可能是自噬参与的机制之一。综上所述，本实验发现高糖环境下促进 VSMCs增殖可能是自噬依赖性的，高糖可通过抑制VSMCs 自噬促进其增殖，而使用而二甲双胍可通过激活 AMPK/PPAR-通路上调 VSMCs 自噬水平，抑制高糖促进的 VSMCs 异常增殖，这为糖尿病合并血管病变提供了一个新的治疗方向。参考文献 Chiong M，Morales P，Torres G，et al.Influence of glucose1metabolism on vascular smooth muscle cellproliferationJ.Vasa，2013，42（1）：8-16.Yang M，Fang J，Liu Q，et al.Role of ROS-TRPM7-ERK1/2 axis in high concentration glucose-mediated pro-liferation and phenotype switching of rat aortic vascularsmooth muscle cellsJ.Biochemical and Biophysical Re-search Communications，2017，494（3-4）：526-533.2Marino G，Niso-Santano M，Baehrecke E H，et al.Self-consumption:The interplay of autophagy and apoptosisJ.Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（2）：81-94.3Wu H，Song A，Hu W，et al.The anti-atherosclerotic ef-fect of paeonol against vascular smooth muscle cell prolif-eration by up-regulation of autophagy via the AMPK/mT-4CrtlABEDUDAPIMergedEDUDAPIMerged1008060*#*#*#*&#(EDU positive cells(%)200HGMETHG+METHG+RAPHG+MET+CCHG+MET+GWHG+MET+RAPCrtlHGMETHG+METHG+MET+CCHG+MET+GWHG+MET+RAPHG+RAP图4二甲双胍抑制高糖诱导的 VSMCs 增殖Fig.4Effectofmetforminonhighglucose-inducedproliferationofVSMCsA：EDV 法检测不同处理组 VSMCs 增殖情况；B：EDV 阳性细胞统计比较。*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001 VS CTRL；#P 0.05，#P 0.001 VS HG，&P 0.05，&P 0.01，&P 0.001 VS HG+MET。第 10 期张紫微，等二甲双胍通过 AMPK/PPAR-通路诱导自噬抑制高糖对血管平滑肌细胞的增殖作用65OR signaling pathwayJ.Frontiers in Pharmacology，2018，8：948.张紫微，杨丽霞，吕晋琳，等.血管紧张素诱发自噬对血管平滑肌细胞表型转换的调控作用J.中国动脉硬化杂志，2017，25（5）：452-456.5Phadwal K，Feng D，Zhu D，et al.Autophagy as a noveltherapeutic target in vascular calcificationJ.Pharmaco-logy&Therapeutics，2020，206：107430.6Peng S，Xu L，Che X，et al.Atorvastatin inhibits inflam-matory response，attenuates lipid deposition，and improvesthe stability of vulnerable atherosclerotic plaques by mod-ulating autophagyJ.Frontiers in Ppharmacology，2018，9：438.7Poznyak A V，Litvinova L，Poggio P，et al.From diabetesto atherosclerosis:Potential of metformin for managementof cardiovascular diseaseJ.International Journal of Mo-lecular Sciences，2022，23（17）：9738.8Yang Q，Yuan H，Chen M，et al.Metformin ameliorates theprogression of atherosclerosis via suppressing macrophageinfiltration and inflammatory responses in rabbitsJ.LifeSciences，2018，198：56-64.9Wu H，Feng K，Zhang C，et al.Metformin attenuates ath-erosclerosis and plaque vulnerability by upregulatingKLF2-mediated autophagy in apoE/-miceJ.Biochem-ical and Biophysical Research Communications，2021，557：334-341.10Phadwal K，Koo E，Jones R A，et al.Metformin protectsagainst vascular calcification through the selective degrad-ation of Runx2 by the p62 autophagy receptorJ.Journalof Cellular Physiology，2022，237（11）：4303-4316.11Yang B，Gao X，Sun Y，et al.Dihydroartemisinin allevi-ates high glucose-induced vascular smooth muscle cellsproliferation and inflammation by depressing the miR-376b-3p/KLF15 pathwayJ.Biochemical and Biophysic-al Research Communications，2020，530（3）：574-580.12Yuan T，Yang T，Chen H，et al.New insights into oxidat-ive stress and inflammation during diabetes mellitus-ac-celerated atherosclerosisJ.Redox Biology，2019，20：247-260.13Tiong Y L，Ng K Y，Koh R Y，et al.Melatonin inhibits highglucose-induced ox-LDL/LDL expression and apoptosis inhuman umbilical endothelial cellsJ.Hormone MolecularBiology and Clinical Investigation，2020，41（4）：1420200009.Zhao Y，Lu N，Zhang Y，et al.High glucose induced rataorta vascular smooth muscle cell oxidative injury:In-volvement of protein tyrosine nitrationJ.Journal ofPhysiology and Biochemistry，2011，67（4）：539-549.15Liu J，Wu J，Sun A，et al.Hydrogen sulfide decreases highglucose/palmitate-induced autophagy in endothelial cellsby the Nrf2-ROS-AMPK signaling pathwayJ.Cell&Bioscience，2016，6（1）：1-17.16Xu K，Liu X，Ke Z，et al.Resveratrol modulates apoptosisand autophagy induced by high glucose and palmitate incardiac cellsJ.Cellular Physiology and Biochemistry，2018，46（5）：2031-2040.17De Jager J，Kooy A，Schalkwijk C，et al.Longterm ef-fects of metformin on endothelial function in type 2 dia-betes:A randomized controlled trialJ.Journal of Intern-al Medicine，2014，275（1）：59-70.18Van der Aa M P，Elst M，Van De Garde E，et al.Long-term treatment with metformin in obese，insulin-resistantadolescents:Results of a randomized double-blindedplacebo-controlled trialJ.Nutrition&Diabetes，2016，6（8）：e228.19He X，Chen X，Wang L，et al.Metformin ameliorates Ox-LDL-induced foam cell formation in raw264.7 cells bypromoting ABCG-1 mediated cholesterol effluxJ.LifeSciences，2019，216：67-74.20Gopoju R，Panangipalli S，Kotamraju S.Metformin treat-ment prevents SREBP2-mediated cholesterol uptake andimproves lipid homeostasis during oxidative stress-in-duced atherosclerosisJ.Free Radical Biology and Medi-cine，2018，118：85-97.21You G，Long X，Song F，et al.Metformin activates theAMPK-mTOR pathway by modulating lncRNA TUG1 toinduce autophagy and inhibit atherosclerosisJ.DrugDesign，Development and Therapy，2020，14：457.22Faghfouri A H，Khajebishak Y，Payahoo L，et al.PPAR-gamma agonists:Potential modulators of autophagy inobesityJ.European Journal of Pharmacology，2021，912：174562.23Wang H，Wang A，Wang X，et al.AMPK/PPAR-/NF-B axis participates in ROS-mediated apoptosis andautophagy caused by cadmium in pig liverJ.Environ-mental Pollution，2022，294：118659.2466昆明医科大学学报第 44 卷