二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理.pdf
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1、18 2023,Vol.44,No.19 食品科学 基础研究二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理蔡 瑾1,闫 然2,3,王梦亮1,王 琪4(1.山西大学应用化学研究所,山西 太原 030006;2.山西大学中医药现代研究中心,山西 太原 030006;3.山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原 030006;4.山西大学生命科学学院,山西 太原 030006)摘 要:食源性病菌给食品安全带来重大的挑战。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)可作为食品防腐剂,但目前鲜见其抑菌机理的相关报道。本实验发现DHQ对6 种食源性致病菌,即金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大
2、肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和热带假丝酵母菌均有显著抑制作用(P0.05),且对大肠杆菌的抑制活性最佳,故以大肠杆菌为指示菌,研究DHQ的抑菌机理。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察,发现在DHQ作用下的大肠杆菌严重变形,表现出黏连、折叠、质壁分离、出现空泡结构等现象。荧光探针被用来测定膜内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,结果显示DHQ能显著增加细胞内的ROS水平(P0.05)。利用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞膜的通透性和完整性,发现随着DHQ质量浓度增加,细胞膜通透性显著增加(P0.05),细胞膜的完整性遭到破坏。使用罗丹明1
3、23检测细胞膜电位,结果表明DHQ会引起大肠杆菌细胞膜去极化,造成膜电位显著降低(P0.05)。细胞膜内Ca2检测结果表明,DHQ会导致胞内Ca2外漏,影响菌体的正常生长代谢和功能活动。采用碘化丙啶/核糖核酸酶(propidium iodide/ribonuclease,PI/RNase)染色缓冲液检测细胞周期,结果表明DHQ干扰了大肠杆菌正常的细胞周期。研究结果揭示了DHQ主要作用于细胞膜,影响正常传代,从而达到抑制大肠杆菌的效果。关键词:二氢槲皮素;抑菌活性;大肠杆菌;抑菌机理Antimicrobial Mechanism of Dihydroquercetin against Esche
4、richia coliCAI Jin1,YAN Ran2,3,WANG Mengliang1,WANG Qi4(1.Institute of Applied Chemistry,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;3.The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Minis
5、try of Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;4.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)Abstract:Foodborne pathogens pose a major challenge to food safety.Dihydroquercetin(DHQ)can be used as a food preservative;however,its antimicrobial mechanism is still unclear.This
6、 study found that DHQ had significant antimicrobial activity against Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Escherichia coli,Proteus vulgaris,Enterobacter aerogenes and Candida tropicalis(P 0.05),the effect being most pronounced against E.coli.The antimicrobial mechanism against E.coli was investig
7、ated.Observation by scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy(TEM)revealed that the DHQ-treated cells became distorted and exhibited phenomena such as adhesion,folding,plasmolysis,and the occurrence of vacuoles.DHQ resulted in a significant increase in the level of reacti
8、ve oxygen species(ROS)inside the cell membrane as determined using a fluorescence probe.The determination of Annexin V-FITC/P kit showed that cell membrane permeability significantly increased with increasing DHQ concentration(P 0.05)and cell membrane integrity was damaged.Cell membrane potential me
9、asurement by Rhodamine 123 staining revealed that DHQ caused cell membrane depolarization,leading to a significant reduction in membrane potential(P 0.05).Moreover,DHQ caused intracellular Ca2+leakage,which perturbed the growth,metabolism and functional activity of E.coli.DHQ interfered with the cel
10、l cycle of E.coli as determined using propidium iodide/ribonuclease(PI/RNase)staining buffer.These findings revealed that DHQ can inhibit E.coli growth mainly by acting on the cell membrane and consequently affecting the normal passage of cells.Keywords:dihydroquercetin;antimicrobial activity;Escher
11、ichia coli;antimicrobial mechanism DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)19-0018-09收稿日期:2022-05-12基金项目:山西省基础研究计划自然科学研究面上项目(20210302123451)第一作者简介:蔡瑾(1982)(ORCID:0000-0003-1597-8143),女,副教授,博士,研究方向为食品安全。E-mail:基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.19 19引文格式:蔡瑾,闫然,王梦亮,等.二氢槲皮
12、素对大肠杆菌的抑菌作用机理J.食品科学,2023,44(19):18-26.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148.http:/CAI Jin,YAN Ran,WANG Mengliang,et al.Antimicrobial mechanism of dihydroquercetin against Escherichia coliJ.Food Science,2023,44(19):18-26.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148.http:/
13、食品工业是国民经济的重要组成部分。随着我国经济的发展,食品的质量和安全问题愈发引起人们的关注,其中由大肠杆菌等食源性病菌导致的食品安全问题尤为突出。食用被大肠杆菌污染的食物往往会造成伤害,如群发性腹泻、呕吐等1。食品中添加防腐剂可以抑制食物源病菌的增长,有效避免食物源病菌对人体造成的危害2。食品防腐剂主要分为两类,即化学防腐剂和天然防腐剂3。化学防腐剂是在食品中使用最广泛的一类防腐剂,但其具有一定的致畸性、致癌性,残存在食品中也会对环境产生影响4-5;天然防腐剂是从植物、动物和微生物中获得的具有抗菌和防腐活性的物质,安全性高且对环境友好6。天然植物防腐剂的主要成分种类繁多、绿色健康且具有良好抗
14、菌性能,可从植物的根、茎、叶等处提取得到7。植物源食品防腐剂符合现代社会对绿色健康消费新趋势的追求8。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ),也称黄杉素、紫杉叶素、花旗松素,是一种从植物中提取出的二氢黄酮醇类化合物,广泛存在于松科、蔷薇科等植物中9-10。有多项研究表明DHQ具有抑菌活性11-13,在食品工业领域可作为食品防腐剂14-16。但是目前鲜见DHQ抑菌机理相关研究的报道,因此本研究测定了DHQ对常见食源性病菌的抑制活性,在确定大肠杆菌作为指示菌的基础上,观察大肠杆菌被DHQ作用后的形态变化,检测其胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平
15、、细胞受损伤程度、膜电位变化、胞内Ca2含量以及细胞周期变化,进而分析大肠杆菌受DHQ抑制的机理。1 材料与方法1.1菌株、材料与试剂革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus、ATCC 25923)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis、ATCC 6633)。革兰氏阴性菌:大肠杆菌(Escherichia coli、ATCC 25922)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris、ATCC 13315)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes、ATCC 13048)。酵母菌:热带假丝酵母菌(Candida tropicalis
16、、ATCC 750)。所有菌种均保藏于山西大学微生物学实验室。供试培养基:细菌培养基(营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基、营养琼脂肉汤(nutrient broth,NB)培养基);酵母菌培养基(酵母甘露醇琼脂(yeast mannitol agar,YMA)培养基、酵母甘露醇肉汤(yeast mannitol broth,YMB)培养基)。戊二醛、罗丹明123(rhodamine 123,RH-123)、醋酸铀、柠檬酸铅德国Sigma公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)天津市大茂化学制剂厂;2,7-二氯荧光素二乙酸酯荧光探针(2,7-dichlo
17、rodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)南京建成生物工程研究所;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI)试剂盒苏州宇恒生物科技有限公司;钙荧光探针(fluo-4 acetoxymethyl ester,Fluo-4 AM)美国Invitrogen公司;碘化丙啶/核糖核酸酶(propidium iodide/ribonuclease,PI/RNase)染色缓 冲液美国Becton dickinson公司。
18、1.2仪器与设备FACS Calibur流式细胞仪美国Becton dickinson公司;JSM-35C扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)、JEM-1011透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)日本JEOL公司。1.3方法1.3.1菌株培养在NB培养基中接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌,摇床培养(160 r/min、37、12 h);将热带假丝酵母菌接种在YMB培养基上,摇床培养(160 r/min、25、12 h)。1.3.2抑菌活性检测和最低抑菌浓度测定
19、DHQ对上述6 种食源性细菌的抑制活性通过琼脂板打孔法测定17。用20%(体积分数,下同)DMSO助溶DHQ,加入到无菌水中,使DHQ的质量浓度达到8 mg/mL。将1.3.1节的菌液用生理盐水稀释至108 CFU/mL。在相应的固体培养基上均匀涂布各受试菌液200 L,用10 mm打孔器在培养基上对称打两个孔。在一个孔中加入上述质量浓度为8 mg/mL的DHQ溶液200 L,另一个孔加入200 L的20%DMSO作为阴性对照。5 种细菌培养条件为37、24 h,热带假丝酵母菌培养条件为25、48 h,培养后测量抑菌圈直径。20 2023,Vol.44,No.19 食品科学 基础研究DHQ对上
20、述6 种食源性致病菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)使用96 孔板测定18。用含7%DMSO液体培养基溶解DHQ,利用二倍稀释法,使DHQ质量浓度范围达到200.02 mg/mL。在96 孔板的各孔中加入200 L含上述不同质量浓度的DHQ液体培养基和5 L(108 CFU/mL)的菌液。阴性对照为只含7%DMSO液体培养基和5 L菌液,不加DHQ样品。5 种细菌的培养条件为37、24 h,热带假丝酵母菌的培养条件为25、48 h。培养后用肉眼观察孔中菌液的浊度,选定使菌液澄清透明的最低DHQ质量浓度为MIC。根据抑菌活性和MIC实验的
21、结果,确定下一步实验的指示菌。1.3.3 SEM和TEM观察使用SEM和TEM来观察大肠杆菌被DHQ抑制后的外部形态及内部结构变化。将DHQ溶解于含0.8%DMSO液体培养基中,使DHQ的最终质量浓度达到1/2 MIC、MIC和2 MIC,并以仅含0.8%DMSO的液体培养基作为阴性对照。吸取100 L的1.3.1节培养的大肠杆菌菌液(108 CFU/mL)加入到100 mL上述液体培养基中,摇床培养(120 r/min、37、12 h)。样品8 000 r/min离心5 min后,弃去上清液,用2.5%戊二醛在4 下固定过夜,然后用1%OsO4固定3 h。SEM观察:固定的样品依次用体积分数
22、30%、50%、70%和100%乙醇溶液做脱水处理20 min。处理后的样品在 80 下冷冻干燥,离子喷金,用SEM观察细胞表面形态。TEM观察:用Epon 618渗透包埋固定后的样品,进行切片处理。用醋酸铀和柠檬酸铅将切片进行双染色,两种染色剂各染1530 min,用TEM观察菌体内部结构变化。1.3.4胞内ROS水平检测根据1.3.3节方法培养菌液,在2 000 r/min下离心10 min,收集菌体,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)(0.01 mol/L,pH 7.27.4,下同)洗两次后,悬浮在20 mol/L DCFH-DA溶液中,避光孵育
23、(37、20 min)。3 000 r/min离心5 min收集菌体,PBS洗涤两次后重悬,在激发波长488 nm及发射波长535 nm的条件下使用流式细胞仪测定其ROS水平。1.3.5 Annexin V-FITC/PI检测根据1.3.3节方法培养菌液,在2 000 r/min离心10 min,收集菌体并重新悬浮在PBS中。根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书所述方法处理重悬液,避光孵育(37、20 min),在3 000 r/min下离心5 min,收集菌体,PBS洗涤两次后重悬,使用流式细胞仪在激发波长488 nm及发射波长530 nm的条件下测定细胞受损程度。1.3.6细
24、胞膜电位检测按1.3.5节方法得到PBS重悬后的菌液,加入RH-123 使染液浓度达到20 mol/L,避光孵育(37、20 min),3 000 r/min离心5 min,收集菌体,用PBS洗 两次后重新悬浮,使用流式细胞仪在激发波长507 nm,发射波长529 nm的条件下测定样品的膜电位。1.3.7胞内Ca2含量测定按1.3.5节方法得到PBS重悬后的菌液,加入Fluo-4 AM使染料终浓度达到4 mol/L,避光孵育(37、30 min),3 000 r/min下离心5 min,收集菌体,用PBS洗两次后重新悬浮,细胞内Ca2含量使用流式细胞仪在激发波长490 nm、发射波长520 n
25、m的条件下测定。1.3.8细胞周期分析按1.3.3节方法培养得到菌液,2 000 r/min离心10 min,收集菌体,PBS洗涤两次后在4 下用体积分数75%乙醇溶液固定过夜后,3 000 r/min离心5 min,将菌体重悬于质量浓度为50 g/mL的含有RNase的PI缓冲液,避光孵育30 min,在激发波长488 nm及发射波长530 nm的条件下使用流式细胞仪测定样品细胞周期。1.4数据处理与分析所有上述实验都平行进行3 次。用SPSS软件对数据进行方差分析(ANOVA)或t检验。图中数据表示为平均值标准差。使用Origin 2018软件作图。2 结果与分析2.1 DHQ对6 种食源
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