二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理.pdf

18 2023,Vol.44,No.19 食品科学 基础研究二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理蔡 瑾1，闫 然2,3，王梦亮1，王 琪4（1.山西大学应用化学研究所，山西 太原 030006；2.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030006；3.山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006；4.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）摘 要：食源性病菌给食品安全带来重大的挑战。二氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）可作为食品防腐剂，但目前鲜见其抑菌机理的相关报道。本实验发现DHQ对6 种食源性致病菌，即金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和热带假丝酵母菌均有显著抑制作用（P0.05），且对大肠杆菌的抑制活性最佳，故以大肠杆菌为指示菌，研究DHQ的抑菌机理。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察，发现在DHQ作用下的大肠杆菌严重变形，表现出黏连、折叠、质壁分离、出现空泡结构等现象。荧光探针被用来测定膜内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，结果显示DHQ能显著增加细胞内的ROS水平（P0.05）。利用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞膜的通透性和完整性，发现随着DHQ质量浓度增加，细胞膜通透性显著增加（P0.05），细胞膜的完整性遭到破坏。使用罗丹明123检测细胞膜电位，结果表明DHQ会引起大肠杆菌细胞膜去极化，造成膜电位显著降低（P0.05）。细胞膜内Ca2检测结果表明，DHQ会导致胞内Ca2外漏，影响菌体的正常生长代谢和功能活动。采用碘化丙啶/核糖核酸酶（propidium iodide/ribonuclease，PI/RNase）染色缓冲液检测细胞周期，结果表明DHQ干扰了大肠杆菌正常的细胞周期。研究结果揭示了DHQ主要作用于细胞膜，影响正常传代，从而达到抑制大肠杆菌的效果。关键词：二氢槲皮素；抑菌活性；大肠杆菌；抑菌机理Antimicrobial Mechanism of Dihydroquercetin against Escherichia coliCAI Jin1,YAN Ran2,3,WANG Mengliang1,WANG Qi4(1.Institute of Applied Chemistry,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;3.The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;4.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)Abstract:Foodborne pathogens pose a major challenge to food safety.Dihydroquercetin(DHQ)can be used as a food preservative;however,its antimicrobial mechanism is still unclear.This study found that DHQ had significant antimicrobial activity against Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Escherichia coli,Proteus vulgaris,Enterobacter aerogenes and Candida tropicalis(P 0.05),the effect being most pronounced against E.coli.The antimicrobial mechanism against E.coli was investigated.Observation by scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy(TEM)revealed that the DHQ-treated cells became distorted and exhibited phenomena such as adhesion,folding,plasmolysis,and the occurrence of vacuoles.DHQ resulted in a significant increase in the level of reactive oxygen species(ROS)inside the cell membrane as determined using a fluorescence probe.The determination of Annexin V-FITC/P kit showed that cell membrane permeability significantly increased with increasing DHQ concentration(P 0.05)and cell membrane integrity was damaged.Cell membrane potential measurement by Rhodamine 123 staining revealed that DHQ caused cell membrane depolarization,leading to a significant reduction in membrane potential(P 0.05).Moreover,DHQ caused intracellular Ca2+leakage,which perturbed the growth,metabolism and functional activity of E.coli.DHQ interfered with the cell cycle of E.coli as determined using propidium iodide/ribonuclease(PI/RNase)staining buffer.These findings revealed that DHQ can inhibit E.coli growth mainly by acting on the cell membrane and consequently affecting the normal passage of cells.Keywords:dihydroquercetin;antimicrobial activity;Escherichia coli;antimicrobial mechanism DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）19-0018-09收稿日期：2022-05-12基金项目：山西省基础研究计划自然科学研究面上项目（20210302123451）第一作者简介：蔡瑾（1982）（ORCID:0000-0003-1597-8143），女，副教授，博士，研究方向为食品安全。E-mail:基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.19 19引文格式：蔡瑾,闫然,王梦亮,等.二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理J.食品科学,2023,44(19):18-26.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148.http:/CAI Jin,YAN Ran,WANG Mengliang,et al.Antimicrobial mechanism of dihydroquercetin against Escherichia coliJ.Food Science,2023,44(19):18-26.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148.http:/食品工业是国民经济的重要组成部分。随着我国经济的发展，食品的质量和安全问题愈发引起人们的关注，其中由大肠杆菌等食源性病菌导致的食品安全问题尤为突出。食用被大肠杆菌污染的食物往往会造成伤害，如群发性腹泻、呕吐等1。食品中添加防腐剂可以抑制食物源病菌的增长，有效避免食物源病菌对人体造成的危害2。食品防腐剂主要分为两类，即化学防腐剂和天然防腐剂3。化学防腐剂是在食品中使用最广泛的一类防腐剂，但其具有一定的致畸性、致癌性，残存在食品中也会对环境产生影响4-5；天然防腐剂是从植物、动物和微生物中获得的具有抗菌和防腐活性的物质，安全性高且对环境友好6。天然植物防腐剂的主要成分种类繁多、绿色健康且具有良好抗菌性能，可从植物的根、茎、叶等处提取得到7。植物源食品防腐剂符合现代社会对绿色健康消费新趋势的追求8。二氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ），也称黄杉素、紫杉叶素、花旗松素，是一种从植物中提取出的二氢黄酮醇类化合物，广泛存在于松科、蔷薇科等植物中9-10。有多项研究表明DHQ具有抑菌活性11-13，在食品工业领域可作为食品防腐剂14-16。但是目前鲜见DHQ抑菌机理相关研究的报道，因此本研究测定了DHQ对常见食源性病菌的抑制活性，在确定大肠杆菌作为指示菌的基础上，观察大肠杆菌被DHQ作用后的形态变化，检测其胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、细胞受损伤程度、膜电位变化、胞内Ca2含量以及细胞周期变化，进而分析大肠杆菌受DHQ抑制的机理。1 材料与方法1.1菌株、材料与试剂革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus、ATCC 25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis、ATCC 6633）。革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli、ATCC 25922）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris、ATCC 13315）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes、ATCC 13048）。酵母菌：热带假丝酵母菌（Candida tropicalis、ATCC 750）。所有菌种均保藏于山西大学微生物学实验室。供试培养基：细菌培养基（营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基、营养琼脂肉汤（nutrient broth，NB）培养基）；酵母菌培养基（酵母甘露醇琼脂（yeast mannitol agar，YMA）培养基、酵母甘露醇肉汤（yeast mannitol broth，YMB）培养基）。戊二醛、罗丹明123（rhodamine 123，RH-123）、醋酸铀、柠檬酸铅德国Sigma公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）天津市大茂化学制剂厂；2,7-二氯荧光素二乙酸酯荧光探针（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）南京建成生物工程研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）试剂盒苏州宇恒生物科技有限公司；钙荧光探针（fluo-4 acetoxymethyl ester，Fluo-4 AM）美国Invitrogen公司；碘化丙啶/核糖核酸酶（propidium iodide/ribonuclease，PI/RNase）染色缓 冲液美国Becton dickinson公司。1.2仪器与设备FACS Calibur流式细胞仪美国Becton dickinson公司；JSM-35C扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、JEM-1011透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）日本JEOL公司。1.3方法1.3.1菌株培养在NB培养基中接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌，摇床培养（160 r/min、37、12 h）；将热带假丝酵母菌接种在YMB培养基上，摇床培养（160 r/min、25、12 h）。1.3.2抑菌活性检测和最低抑菌浓度测定DHQ对上述6 种食源性细菌的抑制活性通过琼脂板打孔法测定17。用20%（体积分数，下同）DMSO助溶DHQ，加入到无菌水中，使DHQ的质量浓度达到8 mg/mL。将1.3.1节的菌液用生理盐水稀释至108 CFU/mL。在相应的固体培养基上均匀涂布各受试菌液200 L，用10 mm打孔器在培养基上对称打两个孔。在一个孔中加入上述质量浓度为8 mg/mL的DHQ溶液200 L，另一个孔加入200 L的20%DMSO作为阴性对照。5 种细菌培养条件为37、24 h，热带假丝酵母菌培养条件为25、48 h，培养后测量抑菌圈直径。20 2023,Vol.44,No.19 食品科学 基础研究DHQ对上述6 种食源性致病菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）使用96 孔板测定18。用含7%DMSO液体培养基溶解DHQ，利用二倍稀释法，使DHQ质量浓度范围达到200.02 mg/mL。在96 孔板的各孔中加入200 L含上述不同质量浓度的DHQ液体培养基和5 L（108 CFU/mL）的菌液。阴性对照为只含7%DMSO液体培养基和5 L菌液，不加DHQ样品。5 种细菌的培养条件为37、24 h，热带假丝酵母菌的培养条件为25、48 h。培养后用肉眼观察孔中菌液的浊度，选定使菌液澄清透明的最低DHQ质量浓度为MIC。根据抑菌活性和MIC实验的结果，确定下一步实验的指示菌。1.3.3 SEM和TEM观察使用SEM和TEM来观察大肠杆菌被DHQ抑制后的外部形态及内部结构变化。将DHQ溶解于含0.8%DMSO液体培养基中，使DHQ的最终质量浓度达到1/2 MIC、MIC和2 MIC，并以仅含0.8%DMSO的液体培养基作为阴性对照。吸取100 L的1.3.1节培养的大肠杆菌菌液（108 CFU/mL）加入到100 mL上述液体培养基中，摇床培养（120 r/min、37、12 h）。样品8 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，用2.5%戊二醛在4 下固定过夜，然后用1%OsO4固定3 h。SEM观察：固定的样品依次用体积分数30%、50%、70%和100%乙醇溶液做脱水处理20 min。处理后的样品在 80 下冷冻干燥，离子喷金，用SEM观察细胞表面形态。TEM观察：用Epon 618渗透包埋固定后的样品，进行切片处理。用醋酸铀和柠檬酸铅将切片进行双染色，两种染色剂各染1530 min，用TEM观察菌体内部结构变化。1.3.4胞内ROS水平检测根据1.3.3节方法培养菌液，在2 000 r/min下离心10 min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.27.4，下同）洗两次后，悬浮在20 mol/L DCFH-DA溶液中，避光孵育（37、20 min）。3 000 r/min离心5 min收集菌体，PBS洗涤两次后重悬，在激发波长488 nm及发射波长535 nm的条件下使用流式细胞仪测定其ROS水平。1.3.5 Annexin V-FITC/PI检测根据1.3.3节方法培养菌液，在2 000 r/min离心10 min，收集菌体并重新悬浮在PBS中。根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书所述方法处理重悬液，避光孵育（37、20 min），在3 000 r/min下离心5 min，收集菌体，PBS洗涤两次后重悬，使用流式细胞仪在激发波长488 nm及发射波长530 nm的条件下测定细胞受损程度。1.3.6细胞膜电位检测按1.3.5节方法得到PBS重悬后的菌液，加入RH-123 使染液浓度达到20 mol/L，避光孵育（37、20 min），3 000 r/min离心5 min，收集菌体，用PBS洗 两次后重新悬浮，使用流式细胞仪在激发波长507 nm，发射波长529 nm的条件下测定样品的膜电位。1.3.7胞内Ca2含量测定按1.3.5节方法得到PBS重悬后的菌液，加入Fluo-4 AM使染料终浓度达到4 mol/L，避光孵育（37、30 min），3 000 r/min下离心5 min，收集菌体，用PBS洗两次后重新悬浮，细胞内Ca2含量使用流式细胞仪在激发波长490 nm、发射波长520 nm的条件下测定。1.3.8细胞周期分析按1.3.3节方法培养得到菌液，2 000 r/min离心10 min，收集菌体，PBS洗涤两次后在4 下用体积分数75%乙醇溶液固定过夜后，3 000 r/min离心5 min，将菌体重悬于质量浓度为50 g/mL的含有RNase的PI缓冲液，避光孵育30 min，在激发波长488 nm及发射波长530 nm的条件下使用流式细胞仪测定样品细胞周期。1.4数据处理与分析所有上述实验都平行进行3 次。用SPSS软件对数据进行方差分析（ANOVA）或t检验。图中数据表示为平均值标准差。使用Origin 2018软件作图。2 结果与分析2.1 DHQ对6 种食源性病菌的抑菌活性对各供试菌的实验组及阴性对照组两者之间的抑菌圈直径进行t检验，图1结果表明DHQ对6 种食源性病菌的抑菌圈直径均在10 mm以上，均显著大于阴性对照的抑菌圈直径（P0.05），即DHQ对6 种食源性病菌均有显著的抑制效果（P0.05）。经ANOVA分析确定DHQ对6 种食源性病菌抑制作用强弱差异，结果表明DHQ对大肠杆菌有最佳的抑制作用（21.13 mm）（P0.05），对普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的抑制作用次之（18.88、18.40 mm），对枯草芽孢杆菌以及产气肠杆菌的抑制作用较弱（14.67、13.90 mm），抑制金黄色葡萄球菌的作用最弱（12.35 mm）。0510152025?/mmd?8 mg/mL DHQ?*c*a*b*b*c*10 mm以上的抑菌圈直径表明有抑菌效果；*.相同供试菌的实验组与阴性对照组之间的抑菌效果差异显著（P0.05）；实验组中不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图 1 DHQ对食源性致病菌的抑制活性Fig.1 Antimicrobial activities of DHQ against foodborne pathogens基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.19 21美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards，CLSI/NCCLS）19规定，可以在不搅拌的情况下用肉眼观察并判断MIC，将抑制程度划分为5 个等级：0级，肉眼未见生长或观察澄清（100%抑制）；1级，肉眼可见轻微模糊（80%抑制）；2级，浊度明显降低（50%抑制）；3级，浊度轻微降低（轻微抑制）；4级，浊度未降低（无抑制）。如表1所示，当DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的处理质量浓度为0.021.25 mg/mL时，培养基呈现不同程度的浑浊现象；当处理质量浓度为2.520 mg/mL时，培养基清澈，没有病菌生长，因此质量浓度2.5 mg/mL被确定为DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的MIC。当DHQ以0.0200.625 mg/mL的质量浓度处理枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌时，培养基表现出不同的浑浊度；当处理质量浓度为1.2520.00 mg/mL时，培养基是清澈的，确定DHQ对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的MIC为1.25 mg/mL。当DHQ对大肠杆菌的处理质量浓度为0.0200.313 mg/mL时，培养基出现浑浊现象；当处理质量浓度为0.62520.000 mg/mL 时，没有病菌生长，确定0.625 mg/mL为DHQ对大肠杆菌的MIC。表 1 DHQ对食源性致病菌的MICTable 1 Minimum inhibitory concentration of DHQ against foodborne pathogens菌种质量浓度/（mg/mL）7%DMSO201052.51.250.6250.3130.1560.080.040.02金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 普通变形杆菌 产气肠杆菌 热带假丝酵母菌 注：.0级，无病原菌生长，100%受抑制；.1级，80%的病原菌受到抑制，仅有少量生长；.2级，有一定的病原菌生长，50%的病原菌受到抑制；.3级，较多病原菌正常生长，仅有轻微抑制效果；.4级，大量病原菌正常生长，无抑制效果。结合抑菌圈直径和MIC检测结果，可以看出DHQ对大肠杆菌具有最强的抑制活性，因此选择大肠杆菌作为进一步研究DHQ抑菌机理的指示菌。2.2 DHQ对大肠杆菌细胞形态及结构的影响SEM和TEM的结果能够直观地反映大肠杆菌被DHQ破坏的情况（图2）。对照组中大肠杆菌细胞表面光滑，呈现出规则的杆状结构（图2A-1、图2E-8）。经DHQ处理后，大肠杆菌的形态与对照组相比有明显不同（图2BD、FH）。图2B、F为由1/2 MIC的DHQ处理的大肠杆菌，虽然有些菌体细胞形态完好，但已经开始出现溶胀聚集现象（图2B-2），内容物溢出 形成了空洞（图2F-9、10），有些细胞出现轻微的质壁分离现象（图2F-11）。经质量浓度为MIC的DHQ处理（图2C、G）后，细胞出现折叠黏连现象（图2C-3、4、5），亦有空泡结构（图2G-12），质壁分离明显（图2G-13）。大肠杆菌被2 MIC的DHQ处理后，亦有折叠现象（图2D-6），菌体结构出现明显的变形（图2H-14、15）、破裂（图2H-16）、降解（图2D-7）。DHQ的化学名为3,5,7,3,4-五羟基-2,3双氢黄酮醇，具有黄酮类化合物的基本结构。DHQ的多羟基位于其结构内部斥电子的大P-共轭体系中，羟基中的氢原子容易脱离。因此，推测DHQ作用大肠杆菌后，羟基中的氢原子可能与细胞膜中的磷脂分子以氢键的形式相结合，使得膜结构变得疏松20-21，导致膜通透性增加，出现菌体肿胀、质壁分离等现象。当DHQ的质量浓度进一步增加，菌体结构变形，并出现黏连破裂等现象。5 m12 m2AB2 m3452 m67CD200 nm8500 nm91011EF500 nm1213500 nm141516GHA.SEM下阴性对照大肠杆菌外部形态（4 800）；BD.分别为SEM下1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌外部形态（6 000、7 800、10 000）；E.TEM下阴性对照大肠杆菌内部结构（150 000）；FH.分别为TEM下1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌内部结构（50 000、80 000、60 000）。图 2 SEM和TEM观察大肠杆菌形态及内部结构Fig.2 SEM and TEM of the morphology and internal structure of Escherichia coli2.3 DHQ对大肠杆菌细胞内ROS水平的影响ROS是生物细胞在代谢过程中产生的一种有氧代谢物，它能维持细胞内氧化还原平衡，与细胞的生长和死亡密切相关22，ROS水平失衡将会引发细胞的一系列功能障碍。DCFH-DA自身不会发出荧光，能够自由进出细胞，并能在细胞内被水解为DCFH，DCFH不能穿透细胞膜，使探针更易在细胞内被装载。无荧光的DCFH能够 22 2023,Vol.44,No.19 食品科学 基础研究被ROS氧化为有荧光的DCF，因此细胞内的ROS水平可以通过DCF的荧光强度反映。由图3可知，与对照组荧光强度（36.65）相比，DHQ处理组的荧光强度分别增加到了41.14（1/2 MIC）、56.99（MIC）以及65.94（2 MIC）。经DHQ处理的大肠杆菌细胞的荧光强度显著高于阴性对照的荧光强度（P0.05）。ROS主要通过氧化呼吸链产生和累积。细菌的呼吸作用主要由细胞膜上相关的酶催化反应进行，因此细胞膜是细菌产生ROS的主要位点。经DHQ处理后，DCFH-DA探针的荧光强度显著增强，推测DHQ可以刺激胞内的ROS过度产生。细胞膜中的脂质会因为过多的ROS而过氧化，导致细胞膜的流动性降低23-25。?0100101102103104306090120150A?36.65DCFH-DA?0100101102103104306090120150B?41.14DCFH-DA?0100101102103104306090120150C?56.99DCFH-DA?0100101102103104306090120150D?65.94DCFH-DA?0?MIC1/2 MIC2 MIC80E10203040506070dbac?AD.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）、1/2 MIC DHQ、MIC DHQ、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌胞内ROS水平；E.大肠杆菌胞内ROS水平方差分析结果；不同小写字母表示差异显著（P0.05），下同。图 3 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌胞内ROS水平Fig.3 Intracellular ROS levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ2.4 DHQ对大肠杆菌细胞膜通透性和完整性的影响磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）通常位于细胞膜的内侧，并会在细胞受损的早期阶段从细胞膜的内侧向外侧移动；Annexin V是一种磷脂结合蛋白，具有与PS特异性结合的高亲和力。Annexin V被FITC荧光素标记后可以作为荧光探针，用于定量检测PS从内侧向外侧的转移，可在流式细胞仪中检测细胞受损的进展情况26。PI是一种核酸染料，在细胞膜的完整性受到破坏后会将核酸染成红色27。因此，以Annexin V-FITC/PI染色后可以通过流式细胞仪检测出大肠杆菌活细胞、受伤细胞和死亡细胞。AnnexinV-FITC/PI双标记图显示4 种不同状态的细胞，左下（LL）、右下（LR）、右上（UR）、左上（UL）分别表示活细胞、受伤细胞、死细胞、坏死细胞与碎片28。结合图4AD可以看出，大肠杆菌在LL区的占比随着DHQ质量浓度的增加而逐渐减少，而LR区域大肠杆菌的占比增加。从图4E、F可以看出，与阴性对照相比，MIC和2 MIC DHQ处理后，正常的大肠杆菌占比显著下降（P0.05），受损细胞占比显著上升（P0.05）。由此推测，DHQ的处理可以使大肠杆菌细胞膜的通透性增加，完整性被破坏，从而影响细胞的正常生理活动，使活细胞减少。PI?100100101102103104101102103104AAnnexinV-FITC?/%UL5403.32UR246 1.51LL14 66190.04LR835 5.13基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.19 23PI?100100101102103104101102103104BAnnexinV-FITC?UL570.35UR475 2.88LL13 72883.25LR2 230 13.52?/%PI?100100101102103104101102103104CAnnexinV-FITC?UL300.18UR40 0.23LL12 21471.46LR4 808 28.13?/%PI?100100101102103104101102103104DAnnexinV-FITC?UL280.17UR640.39LL10 22461.94LR6 190 37.50?/%0?MIC1/2 MIC2 MIC100E102030405060708090abba?/%?0?MIC1/2 MIC2 MIC45F510152025303540caab?/%?AD.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）及1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌AnnexinV-FITC/PI双标记染色结果。E、F.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）及1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后大肠杆菌正常细胞占比和受损细胞占比的方差分析。图 4 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌细胞膜的通透性Fig.4 Evaluation of cell membrane permeability of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ2.5 DHQ对大肠杆菌细胞膜电位的影响膜电位是由细胞膜内外电势差产生的，反映了菌体新陈代谢。因此，细胞膜电位是细胞的一种功能性参数，在细菌代谢活动中起着重要作用，可反映细胞膜的完整性和菌体生理状态29。RH-123是一种阳离子亲脂性荧光物质，可以通过跨膜电位进入细胞，其荧光强度通过流式细胞仪检测后可反映膜电位的变化30。如图5所示，阴性对照表现出较强的荧光强度，为68.97，随着DHQ质量浓度的增加，荧光强度逐渐降低，1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后的大肠杆菌荧光强度分别为43.38、35.07、34.69。与阴性对照相比，DHQ处理后的大肠杆菌细胞荧光强度显著降低（P0.05）。以上结果表明，RH-123进入细胞内的动力减弱，即细胞膜内外电势差减少，由此可以推测出DHQ会引起大肠杆菌细胞膜去极化，使膜电位降低，进一步造成胞内离子紊乱，细胞的正常生理功能受到损伤。?0100101102103104306090120150A?68.97RH-123?0100101102103104306090120150B?43.38RH-123?0100101102103104306090120150C?35.07RH-123?0100101102103104306090120150D?34.69RH-123?24 2023,Vol.44,No.19 食品科学 基础研究0?MIC1/2 MIC2 MIC80E10203040506070accb?AD.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）及1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌细胞膜电位；E.经0.80%DMSO（阴性对照）、1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后大肠杆菌细胞膜电位的方差分析。图 5 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌细胞膜电位水平Fig.5 Cell membrane potential levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ2.6 DHQ对大肠杆菌细胞内Ca2含量的影响胞内Ca2是一种调节细胞功能的重要因子，可以作为第二信使广泛参与细胞运动、代谢等多种功能活动，还参与维持细胞跨膜运输31。如图6所示，与对照组的荧光强度（44.31）相比，DHQ处理组的荧光强度减少到了33.13（1/2 MIC）、29.82（MIC）以及28.33（2 MIC）。大肠杆菌被DHQ处理后的荧光强度与阴性对照相比显著降低（P0.05）。在正常细胞中，胞内Ca2的含量处在稳定水平，当细胞膜通透性受损后，会导致Ca2的外漏。因此，胞内Ca2含量的变化可以反映出细胞膜通透性的变化。以上结果表明DHQ处理后的大肠杆菌胞内Ca2含量减少，推测DHQ可导致细胞膜损伤、Ca2外漏，并直接影响到由Ca2所参与的菌体的正常生长代谢和功能活动。?0100101102103104140280420560700A?44.31Fluo-4 AM?0100101102103104140280420560700B?33.13Fluo-4 AM?0100101102103104140280420560700C?29.82Fluo-4 AM?0100101102103104140280420560700D?28.33Fluo-4 AM?0?MIC1/2 MIC2 MIC70E102030405060abbb?AD.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）、1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌胞内Ca2含量；E.经0.80%DMSO（阴性对照）、1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后大肠杆菌胞内Ca2含量的方差分析。图 6 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌胞内Ca2含量Fig.6 Intracellular Ca2+levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ2.7 DHQ对大肠杆菌细胞周期的影响原核细胞周期中的I期为DNA复制准备期，R期为DNA复制期。图7显示了DHQ处理后对大肠杆菌细胞周期的影响。经DHQ处理后，处于I期的大肠杆菌占比从82.99%（阴性对照）下降到了73.26%（1/2 MIC）、71.96%（MIC）、64.84%（2 MIC），处于R期的大肠杆菌占比从17.01%（阴性对照）上升到了26.74%（1/2 MIC）、28.04%（MIC）、35.16%（2 MIC）。DHQ处理后大肠杆菌处于I期的占比与对照组相比显著下降（P0.05），处于R期的占比显著上升（P0.05）。以上结果表明，DHQ对大肠杆菌的抑制作用与其干扰细胞周期有关。推测原因可能为DHQ损伤菌体的细胞膜，进入细胞内部，引起ROS在菌体内聚集，破坏了与DNA合成有关的酶或蛋白质，从而干扰了大肠杆菌正常的细胞周期32。?0050100150200200400600800AI?I：82.99%R：17.01%R?FL2-A?基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.19 25?005010015020070140210280BI：73.26%R：26.74%?FL2-A?I?R?004080120160200100200300400500CI：71.96%R：28.04%?FL2-A?I?R?0050100150200200400600800DI：64.84%R：35.16%?FL2-A?I?R?0?MIC1/2 MIC2 MIC100E102030405060708090abbbI?/%?0?MIC1/2 MIC2 MIC50F10203040baaaR?/%?AD.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）、1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理的大肠杆菌细胞周期；E、F.分别为经0.80%DMSO（阴性对照）、1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后大肠杆菌处于I期和R期占比的方差分析。图 7 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌的细胞周期Fig.7 Cell cycle of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ3 结 论从植物中提取的DHQ可以抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和热带假丝酵母菌的生长，其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，所以选择大肠杆菌作为抑菌机理实验的指示菌。DHQ