大球盖菇风味肽高效制备及其ACE抑制活性.pdf
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1、大球盖菇风味肽高效制备及其 ACE 抑制活性李文1袁2袁陈万超1袁马海乐2*袁吴迪1袁张忠1袁杨焱1*渊1上海市农业科学院食用菌研究所国家食用菌工程技术研究中心农业农村部南方食用菌资源利用重点研究室上海 2014032江苏大学食品与生物工程学院食品物理加工研究院江苏镇江 212013冤摘要以基料呈味特性和肽产量为指标袁通过响应面工艺优化袁获得大球盖菇风味肽高效制备酶解工艺袁即酶解时间 51.62min袁碱性蛋白酶加酶量 0.99%渊酶活力 200 000 U/g冤袁酶解温度 42.03 益袁底物质量浓度 48.45 g/L遥在传统酶解最优制备工艺基础上袁采用同步超声辅助定向酶解技术制备大球盖菇
2、富肽风味基料袁平板超声辅助酶解 30 min 时袁基料中肽含量渊469.21 mg/g 干重冤可达到传统酶解最优条件下的产肽量袁基料制备时间显著缩短曰辅助酶解 40 min 时的产肽量渊492.87mg/g 干重冤较传统酶解产肽量提升了 6.5%遥 同步超声定向酶解制备的富肽基料袁在咸味和鲜味呈味特性上袁分别较传统酶解基料提升了 1.11.8 倍和 1.11.3 倍遥所有制备工艺得到的富肽基料均具有较优的血管紧张素转化酶渊ACE冤抑制活性袁半抑制浓度渊IC50冤分别为 0.071袁0.074袁0.122 mg/mL 和 0.123 mg/mL遥通过对大球盖菇风味肽氨基酸序列分析发现袁肽链中存在
3、天冬氨酸渊D冤尧缬氨酸渊V冤尧谷氨酸渊E冤尧亮氨酸渊L冤尧甘氨酸渊G冤尧精氨酸渊R冤尧脯氨酸渊P冤尧丙氨酸渊A冤的氨基酸组合肽段 DD尧VV尧EL尧VG尧VE尧RP尧RA尧RV尧VR 时袁多肽呈现咸鲜味呈味特性遥 上述氨基酸组合占比较高袁可能是基料呈咸鲜味的主要原因遥 计算机模拟分子对接技术对大球盖菇风味肽体外抑制 ACE 活性的预测结果显示袁风味肽可与 ACE 活性口袋氨基酸残基形成氢键袁推测这是风味肽发挥 ACE 抑制作用的主要原因遥 本研究结果为大球盖菇风味富肽基料的高效制备及开发应用提供理论依据袁为制备减盐增鲜调味品尧降血压功能食品或食品添加剂提供参考遥关键词大球盖菇曰 风味肽曰 呈味
4、特性曰 ACE 抑制活性曰 分子对接文章编号1009-7848渊2023冤08-0229-12DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.024食用菌是一种高蛋白尧低脂肪的健康食品袁其所含生物活性物质可用来解决医学和生物技术方面的问题遥以食用菌为原料开发的保健食品尧功能食品和药品袁 其深加工后的产品价值可比原料提高 34 倍1遥 食用菌种类繁多袁根据栽培基质的不同袁分为草腐菌和木腐菌遥 大球盖菇又名赤松茸袁是草腐菌中具有很高秸秆利用率的食用菌2袁在上海郊区广泛种植袁 助力解决目前秸秆还田中存在的诸多问题遥随着大球盖菇栽培推广及产量提升袁鲜菇市场供大于需袁导致鲜菇价格下跌
5、袁进行精深加工是延伸大球盖菇产业链尧 提升价值链的重要措施遥 大球盖菇风味独特袁富含蛋白尧多肽及氨基酸等营养物质3袁是开发天然风味基料和营养健康产品的优质原料遥研究人员围绕大球盖菇多糖尧甾醇尧黄酮等活性成分和成分的抗氧化尧抑菌等功能进行研究和报道4袁而其风味物质尚未有效地开发利用遥大球盖菇风味肽是一种菌物源性的天然呈味物质袁是大球盖菇深加工新的研究方向遥风味肽具有的风味特性和营养价值袁 不仅能带来愉悦的味觉感受袁还能提供多肽及氨基酸等营养成分袁在保障人体健康中发挥着重要的营养作用和生物活性遥如已报道的咸味二肽5袁其咸味强度与 NaCl 相当袁对患有高血压尧心血管疾病等需要低钠饮食的特殊人群有着
6、重要的利用价值曰 甜味二肽阿斯巴甜及其衍生物不会使血糖升高袁适合于肥胖症尧糖尿病和心血管病人食用6遥 在食用菌风味肽研究中袁鲜味肽尧厚味肽等感官风味肽的研究较多7-11遥大球盖菇风味肽呈味特性及其潜在的生物活性袁还有待进一步挖掘遥超声技术因高效绿色尧无污染等特点袁已在农产品食品加工领域进行应用12-13遥超声技术在食用菌领域的应用袁多聚焦于食用菌原料预处理14-16尧有效成分提取17-19尧辅助酶解20尧辅助发酵21-23等遥收稿日期院 2023-01-31基金项目院 上海现代农业产业技术体系项目沪农科产字渊2023冤第 9 号第一作者院 李文袁女袁博士袁副研究员通信作者院 马海乐E-mail
7、院 杨焱E-mail院 灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期本研究探索性地将平板超声技术应用于酶解反应全过程袁通过对大球盖菇低值菌物蛋白渊残次菇及菇柄冤定向酶解制备富肽风味基料进行研究袁挖掘兼具愉悦感官呈味特性和生物活性的大球盖菇风味活性肽袁实现风味活性特征性成分的有效利用遥本研究对提升大球盖菇产品附加值具有参考意义遥 开发的富肽基料也可作为一种重要的
8、食品和药品新资源进行应用袁 符合我国大健康产业的发展需求遥1材料与方法1.1材料与试剂大球盖菇残次菇及菇柄原料由上海菇林源菌业专业合作社提供袁 大球盖菇栽培品种为球盖菇5 号揖沪农品认食用菌渊2004冤第 062 号铱遥 原料鲜菇样品采用热风干燥方式进行干制渊干燥温度 55益袁 通风量 3 500 m3/h袁 干燥 6 h袁 水分含量低于8%冤遥 将大球盖菇干品剪切至长尧 宽分别约为 3mm 的菇丁作酶解原料遥所用水解蛋白酶信息如表1 所示遥 肽含量测定试剂盒袁苏州梦犀生物医药科技有限公司曰DOJINDO 同仁化学 ACE Kit-WST试剂盒袁上海宥露生物科技有限公司曰恒大弱碱性水渊pH 7
9、.87.9冤袁京东商城曰柠檬酸尧蔗糖尧异亮氨酸尧氯化钠尧谷氨酸钠袁北京索莱宝科技有限公司曰乙腈尧甲酸袁美国 Thermo 公司曰其它试剂渊分析纯级冤袁国药集团化学试剂有限公司遥名称酶活温度/益pH 范围供应商信息胰蛋白酶250.N.F.U/mg376.58.5诺维信 Novozymes中性蛋白酶50 U/mg506.07.0上海麦克林生化科技有限公司碱性蛋白酶200 000 U/g508.5-10.5北京索莱宝科技有限公司风味蛋白酶500 LAPU/g505.57.5诺维信 Novozymes木瓜蛋白酶2 000 U/mg506.07.0生工生物工程渊上海冤股份有限公司胃蛋白酶3 000 U/
10、mg371.52.0上海麦克林生化科技有限公司复合蛋白酶1.6 AU-N/g505.57.5诺维信 Novozymes表 1蛋白酶信息Table 1Protease information1.2仪器与设备AKTA Flux 6 切向流膜过滤系统袁 格来赛生命科技渊上海冤有限公司曰中空纤维膜渊约3 000 u冤袁通用电气渊中国冤医疗集团曰Bio-Tek Epoch 2 酶标仪袁 美国 BioTek 公司曰Christ Alpha 2-4 LDplus真空冷冻干燥机袁德国 Christ 公司曰聚能超声装备VCX1500袁美国 Sonics&Materials 公司曰平板超声装备 SB25-12DN
11、T袁 宁波新芝生物科技股份有限公司曰TS-5000Z Insent 电子舌味觉分析系统袁北京盈盛恒泰科技有限责任公司曰Thermo EASY-nLC 液相色谱仪尧Thermo Scientific QE-orbitrap质谱仪尧75 滋m i.d.伊 150 mm Acclaim PepMapRSLC C18 nanoViper 色谱柱袁美国 Thermo 公司遥1.3方法1.3.1大球盖菇原料预处理方法经原料成分分析可知袁 本研究所采用的大球盖菇原料中粗蛋白含量为渊46.47 依 3.60冤g/100 g 干重遥 采用前期优化的聚能超声原料处理工艺 渊超声功率密度 300 W/L袁工作频率
12、20 kHz袁超声处理 20 min冤进行原料预处理袁 预处理后的原料水溶液中可溶性蛋白含量达到 203.36205.40 mg/g 干重遥1.3.2大球盖菇富肽基料酶解制备蛋白酶筛选方法取 1.3.1 节预处理得到的原料液袁根据水解蛋白酶推荐使用 pH 值范围渊详见表 1冤袁采用 1 mol/L 氢氧化钠和 1 mol/L 盐酸调节大球盖菇预处理原料液 pH 值曰分别加入表 1 中的蛋白酶袁蛋白酶的添加量为原料液中菇丁质量的 1%曰各蛋白酶酶解温度按照蛋白酶推荐使用温度袁酶解时间为 60min袁得到各个处理的酶解液遥 酶解液于 100 益水浴灭酶 10 min 后袁4 000 r/min 离
13、心 10 min袁收集上清液遥以上清液中多肽含量尧电子舌风味评价值为指标袁进行酶解反应水解蛋白酶筛选试验袁考察蛋白酶种类对酶解反应风味肽产量及呈味特性的影响遥230第 23 卷 第 8 期1.3.3大球盖菇富肽基料酶解制备工艺优化方法取 1.3.1 节预处理得到的原料液及 1.3.2 节优选水解蛋白酶袁进行酶解反应单因素实验遥以酶解上清液中多肽含量为指标袁 确定较优的酶解反应单因素水平区间遥根据单因素实验结果袁选择对产肽量影响较大的因素及水平袁以多肽含量为响应值袁采用 Design-Expert 8.0.6 软件设计 Box-Benhnken试验袁 优化酶解反应制备大球盖菇富肽风味基料工艺遥1
14、.3.4同步超声定向酶解制备大球盖菇富肽基料方法采用 1.3.3 节优化的传统酶解工艺以及前期优化的促蛋白水解超声作用条件 渊平板超声功率密度 120 W/L袁超声工作频率 20 kHz冤袁进行同步超声定向酶解制备大球盖菇富肽基料遥 以酶解上清液中多肽含量为指标袁 确定促风味肽产生的最优超声作用时间遥1.3.5大球盖菇风味基料肽含量和 ACE 抑制活性分析方法收集 1.3.3 节和 1.3.4 节最优工艺制备的酶解液上清液 渊标记为传统或超声辅助酶解原液冤袁采用超滤技术对酶解原液进行超滤袁收集分子质量小于 3 000 u 的超滤液渊标记为传统或超声辅助酶解超滤液冤遥 酶解原液及超滤液于-70
15、益冷冻干燥 48 h 后收集冻干风味基料袁对基料肽含量尧呈味特性及 ACE 抑制活性进行分析遥 基料肽含量测定采用肽含量测定试剂盒渊BCA 法冤袁呈味特性分析采用电子舌味觉传感器袁ACE 抑制活性测定采用 ACE Kit-WST 试剂盒遥肽含量测定方法如下院 称取 0.1 g 冻干基料袁加入 1 mL 试剂盒提取液袁 冰浴匀浆静置 30 min后袁12 000 r/min袁4 益离心 10 min袁收集上清液遥 取10 滋L 上清液样品袁加入 190 滋L 试剂盒工作液袁60益烘箱保温 30 min袁 于波长 562 nm 处测定吸光值袁肽含量计算公式为院肽含量渊mg/g 干重冤=标准品质量浓
16、度伊渊样品测定的吸光值-空白测定的吸光值冤衣渊标准品测定的吸光值-空白测定的吸光值冤伊V提衣W遥 标准品为四肽标准品袁质量浓度为0.5 mg/mL曰 空白为水曰V提为入的提取液的体积渊1 mL冤曰W 为基料质量渊g冤遥 以冻干基料中多肽含量为指标袁 比较响应面优化工艺中不同因素水平制备富肽基料的能力遥大球盖菇富肽基料风味评价采用 TS-5000ZInsent 电子舌内置方法遥称取 0.1 g 冻干基料袁加入100 mL 纯水溶解袁移取 25 mL 溶液加入电子舌专用样品杯中袁每个样品重复测试 4 次袁取后 3 次测试结果遥 标准味觉对照溶液采用 0.08%柠檬酸溶液渊酸味对照冤袁1%蔗糖溶液渊
17、甜味对照冤袁0.25%异亮氨酸溶液渊苦味对照冤袁0.35%氯化钠溶液渊咸味对照冤和 0.35%谷氨酸钠溶液渊鲜味对照冤遥 由 4名男性和 6 名女性渊年龄在 24 至 27 岁之间冤组成感官评估小组袁 将感官评价数值与电子舌评价数值进行比较袁 选 2 种评价趋势一致的感官评价小组成员渊5 名及以上冤袁对风味基料进行综合感官评价描述遥ACE 抑制活性测定方法如下院 取冻干基料纯水配置 10 mg/mL 样品原液袁采用稀释率 1袁1/5袁1/52袁1/53袁1/54袁1/55袁1/56纯水稀释得待测样品溶液遥取 20 滋L 样品溶液袁 加入 20 滋L 试剂盒基质缓冲液和 20 滋L 试剂盒酶工作
18、液袁37 益培养 60 min袁加入 200 滋L 试剂盒指示液袁 室温下培养 10 min袁于波长 450 nm 处测定吸光值遥 ACE 抑制剂活性值渊%冤=渊无抑制全显色的吸光值-样品测定的吸光值冤衣渊无抑制全显色的吸光值-试剂空白对照吸光值冤伊100遥 试剂空白对照为 40 滋L 纯水袁加 20 滋L试剂盒基质缓冲液和 200 滋L 试剂盒指示液遥 分别以样品质量浓度和抑制剂活性值为横纵坐标轴制作抑制曲线袁 由抑制曲线得到抑制率 50%时样品的质量浓度遥1.3.6大球盖菇酶解制备富肽基料中风味肽序列分析方法选取呈味特性及 ACE 抑制活性较优的大球盖菇富肽基料袁 采用液相色谱串联质谱分析
19、 技 术渊Liquidchromatographytandem-massspectrometry袁 LC-MS/MS冤对大球盖菇风味基料中肽段进行氨基酸序列分析遥 基料样品经 MilliporeZipTip C18 微量层析柱脱盐处理后袁 采用 20 滋L溶解液渊0.1%甲酸尧5%乙腈冤溶解肽段袁涡旋振荡袁13 500 r/min袁4 益离心 20 min袁收集上清液并转移到上样管中袁取 8 滋L 样品液进行质谱肽段序列分析鉴定遥 液相色谱流动相 A袁0.1%甲酸曰流动相 B袁0.1%甲酸袁80%乙腈曰LC-MS/MS 设置参数如表 2所示遥 采用 PEAKS 软件进行数据库检索遥大球盖菇风味
20、肽高效制备及其 ACE 抑制活性231中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期液相设置参数质谱设置参数时间/min流速/nL 窑 min-1A/%B/%参数数值0.00400973一级质谱分辨率120 0003.00400973自动增益控制4伊1057.00400928离子最大注入时间/ms5046.004006832质量扫描范围/m 窑 z-13501 55051.004005644二级质谱分辨率30 00056.00400199自动增益控制1伊10560.00400199离子最大注入时间/ms10060.10300973一级质谱中选择进行二级碎裂的离子数2070.00400973NCE
21、 模式碰撞能量32表 2LC-MS/MS 参数设置Table 2LC-MS/MS parameter settings1.3.7大球盖菇酶解制备风味肽活性作用机制预测方法采用 BIOPEP-UWM 网站渊https院/bio鄄chemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/冤对鉴定得到的活性肽进行风味预测袁筛选呈味较优的风味肽遥采用计算机分子对接技术模拟风味肽与 ACE 受体蛋白之间的结合状态袁 对风味肽活性作用机制进行预测遥 采用 Discovery Studio 2019 软件对 ACE 受体渊PDB院1O86冤进行去除水分子袁保留 Zn2+和 Cl-袁补充完整的氨基酸残基等处理
22、和结构优化24遥 利用软件 CDOCKER 模块进行风味肽与 ACE 的半柔性对接袁结合能力以野原CDOCKER Energy冶值表示遥挑选亲和力最高渊能量最小冤的复合物结构袁分析风味肽与 ACE 受体的结合位点和作用方式袁预测风味肽发挥 ACE 抑制活性的作用机制遥1.4数据处理与分析响应面试验所得数据以 3 次测定结果的平均值依标准差表示袁采用 Design-Expert 8.0.6 软件处理和分析遥基料 ACE 抑制活性袁采用 Excel 软件处理和分析遥 采用 SPSS 20.0 软件进行电子舌采集数据主成分分析 渊Principal component analysis袁PCA冤遥2
23、结果与分析2.1蛋白酶筛选结果蛋白酶酶解制备的富肽基料电子舌风味评价PCA 分析结果如图 1a 所示渊对照样品为相同底物质量浓度尧电压力锅浸提 2 h 提取制备样品冤遥 研究发现袁中性蛋白酶尧碱性蛋白酶尧胃蛋白酶和复合蛋白酶酶解制备的富肽基料袁 与咸味和鲜味参照标品风味接近袁4 种酶可作为呈咸呈鲜富肽风味基料酶解制备候选酶遥 进一步对各蛋白酶酶解制备的基料中肽含量分析袁由结果可知袁碱性蛋白酶酶解基料中肽含量最高袁达到 311.05 mg/g 干重渊图 1b冤遥 因此袁基于大球盖菇蛋白酶酶解制备的富肽基料风味评价和肽含量结果袁 优选碱性蛋白酶进行呈咸尧呈鲜富肽基料酶解制备工艺研究遥2.2酶解工艺
24、优化结果结合前期单因素筛选结果袁 优选酶解时间3090 min尧 加酶量 0.5%1.5%尧 酶解温度 4060益和底物质量浓度 4060 g/L 进行响应面优化遥 为了避免酶解过程中酸尧碱调节 pH 值引入钠离子袁影响肽基料风味评价结果袁 在酶解工艺优化反应中不做 pH 值调节遥 在本研究限定的酶解条件下袁采用食品级弱碱性水袁可以保证酶解条件遥响应面试验结果如图 2 和表 3 所示遥 基于响应面试验结果利用软件预测出的富肽基料最优酶解制备工艺条件为院酶解时间 51.62 min袁加酶量 0.99%袁酶解温度 42.03 益袁底物质量浓度 48.45 g/L遥经验证袁该工艺条件实际产肽量平均值
25、为 461.31 mg/g 干重袁与模型理论预测值 466.51 mg/g 干重相比袁相对误差为 1.13%袁模型预测最优酶解制备工艺可信遥 该酶解工艺制备的大球盖菇风味基料肽含量袁 较高压浸提子实体原液中肽含量渊119.20 mg/g 干重冤提升了 2.87 倍遥232第 23 卷 第 8 期PC1渊87.98%冤蛋白酶Protease渊a冤不同蛋白酶酶解制备基料的电子舌风味评价结果渊b冤不同蛋白酶酶解制备基料的肽含量分析图 1不同蛋白酶酶解制备基料的电子舌风味评价及肽含量分析图Fig.1Electronic tongue flavor evaluation and peptide cont
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