川芎嗪-丹参配伍前后在急性心肌缺血模型大鼠体内的组织分布差异研究.pdf
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1、2023 年 9 月第 33 卷 第 9 期中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINESeptember,2023Vol.33 No.9李容,勾健,刘亭,等.川芎嗪-丹参配伍前后在急性心肌缺血模型大鼠体内的组织分布差异研究 J.中国比较医学杂志,2023,33(9):8-15.Li R,Gou J,Liu T,et al.Tissue distribution of ligustrazine-Salvia miltiorrhiza before and after compatibility in acute myocardial ische
2、mia model rats J.Chin J Comp Med,2023,33(9):8-15.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2023.09.002基金项目国家自然科学基金(81803827);贵州省优秀青年科技人才项目(黔科合平台人才20215619 号);贵州省普通高等学校科技拔尖人才项目(黔教合 KY 字2021033)。作者简介李容(1997),女,硕士研究生,研究方向:中药药物代谢动力学。E-mail:lr30856 通信作者孙佳(1986),女,副教授,研究方向:中药药效物质基础与药动学。E-mail:392828662 川芎嗪-丹参配伍前后在急性心肌
3、缺血模型大鼠体内的组织分布差异研究李 容1,3,勾 健1,3,刘 亭2,巩仔鹏1,陆 苑1,刘春花2,黄 勇1,孙 佳1(1.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室,贵阳 550004;2.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心,贵阳 550004;3.贵州医科大学 药学院,贵阳 550004)【摘要】目的 对盐酸川芎嗪与丹参配伍前后在急性心肌缺血(acute myocardial ischemia,AMI)模型大鼠体内的组织分布差异进行探讨。方法大鼠皮下注射盐酸异丙肾上腺素溶液复制 AMI 模型,分为川芎嗪组(ligustrazine,
4、LG)、丹参组(Danshen,DS)和川芎嗪-丹参组(ligustrazine-Danshen,LD),采用 UPLC-MS/MS 方法测定不同时间点下川芎嗪和丹参素 2 种活性成分在心脏、肝、脾、肺、肾、脑组织中的含量差异。结果 注射后川芎嗪和丹参素在 AMI 大鼠各组织中分布广泛且迅速达峰;配伍前后,各组川芎嗪在脑组织中含量最高,在肝组织中含量最低;丹参素在肾组织中含量最高,在脑组织中含量最低,表明川芎嗪较丹参素更易透过血脑屏障,且主要蓄积组织有所差异;而配伍用药显著增加了川芎嗪和丹参素在靶器官心脏中的 AUC(P0.001)。结论 推测川芎嗪与丹参配伍可能是通过增加主要药效成分在心脏中
5、的分布增强治疗作用,进而能更好地发挥药效。【关键词】川芎嗪-丹参;配伍;组织分布;差异【中图分类号】R-33 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2023)09-0008-08Tissue distribution of ligustrazine-Salvia miltiorrhiza before and after compatibility in acute myocardial ischemia model ratsLI Rong1,3,GOU Jian1,3,LIU Ting2,GONG Zipeng1,LU Yuan1,LIU Chunhua2,HUANG Yong1
6、,SUN Jia1(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics,State Key Laboratory of Efficacy and Utilization of Medicinal Plants,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China.2.Ministry of Education Engineering Research Center for Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine Development and
7、 Application,Guizhou Medical University,Guiyang 550004.3.School of Pharmaceutical Sciences,Guizhou Medical University,Guiyang 550004)【Abstract】Objective To investigate the difference in tissue distribution of ligustrazine hydrochloride and Salvia miltiorrhiza(Danshen)in acute myocardial ischemia(AMI
8、)model rats.Methods A rat model of AMI was induced by subcutaneous injection of isoproterenol hydrochloride solution.The rats were then divided into a ligustrazine group,Danshen group,and ligustrazine-Danshen group.Ligustrazine and Danshensu levels in the heart,liver,spleen,lung,kidney,and brain wer
9、e detected at different time points by ultra-high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry.Results Ligustrazine and Danshensu were widely distributed and peaked rapidly in tissues of AMI rats after intravenous injection.Before and after compatibility,the content of ligustrazine was
10、 highest in brain tissue and lowest in liver tissue,while the Danshensu content was highest in kidney tissue and lowest in brain tissue,indicating that ligustrazine could penetrate the blood-brain barrier more easily than Danshensu,and the main sites of accumulation were different.The areas under th
11、e curves of ligustrazine and Danshensu in the heart as the target organ were significantly increased(P0.001).Conclusions These result suggest that the combination of ligustrazine and Danshen may enhance the therapeutic effect by increasing the distribution of the main pharmacodynamic components in t
12、he heart,thus improving the efficacy.【Keywords】ligustrazine-Salvia miltiorrhiza;compatibility;tissue distribution;differenceConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.冠状动脉心脏病是全球流行病中发病率和死亡率的主要原因,心肌缺血是冠心病的代表性病理过程,其特征是心肌血氧供需失衡,引起心脏代谢紊乱、心律失常、心肌梗死、猝死1。由盐酸川芎嗪和丹参配伍组成的参芎葡萄糖注射液(Shenxio
13、ng glucose injection,SGI)在临床上广泛用于治疗无症状心肌缺血、心力衰竭、心绞痛、急性缺血性中风等多种疾病,且临床效果显著2-3。药理作用研究显示 SGI 具有抗氧化应激和抗凋亡作用4,同时 SGI可能通过环氧合酶途径等生物过程治疗缺血再灌注损伤,其主要与脂肪细胞脂解、血小板活化的调控等信号通路密切相关5。中药复方是中药临床应用的主要形式,配伍通过引起药物代谢酶和转运蛋白的改变从而导致药物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程发生变化6。而机体是否处于病理状态以及疾病的严重程度同样对药物的 ADME 过程有不同的影响,因此在病理状态下研究药物配伍前后的体内过程具有更重要
14、的临床意义。目前对于丹参和川芎嗪的报道主要集中在正常状态下单一成分的药动学和体内分布研究7-8,课题组前期研究发现,在单次给药后,川芎嗪-丹参配伍组急性心肌缺血(AMI)大鼠体内川芎嗪的 AUC 显著降低,Vz 升高9,提示配伍降低了川芎嗪的吸收而加快了分布。可见配伍改变了活性成分在体内的药动学行为,但是对其组织分布的影响不得而知。鉴于该部分研究未见报道,本实验基于 AMI 大鼠模型,通过考察川芎嗪-丹参配伍前后各组中川芎嗪和丹参素这两种活性成分的组织分布差异,进一步从体内过程变化的角度揭示药物配伍的机理,对临床合理用药提供参考。1 材料和方法1.1 实验动物 79 周龄 SPF 级健康雄性
15、Sprague-Dawley(SD)大鼠 96 只,体重为 230270 g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供SCXK(辽)2020-0001,实验动物饲养于贵州医科大学实验动物中心SYXK(黔)2018-0001,于温度为 2225、相对湿度为45%60%的动物房内适应性饲养 1 周后用于后续实验。所有实验方案研究都得到了贵州医科大学动物伦理委员会的批准(1801210),并按实验动物使用的 3R 原则给予人道关怀。1.2 主要试剂与仪器 丹参浸膏(贵州景峰注射剂有限公司,批号07200801);盐酸异丙肾上腺素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号 G2028261,纯度99%);丹参素
16、、盐酸川芎嗪、葛根素对照品(上海源叶生物科技 有 限 公 司;批 号 分 别 为 H09N10S102463、X08O9C71471、S02 M9B54875,纯度均98%);木犀草苷对照品(成都埃法生物科技有限公司,批号AF20072618,纯度 98%);甲 醇(色 谱 纯,美 国Fisher 公司);乙腈、甲酸(色谱纯,德国 Merck 公司);其他试剂均为分析纯;实验用水为屈臣氏蒸馏水。ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S 型超高效液相串联三重四极杆质谱联用仪(TQS,美国 Waters公司)、ACQUITY UPLC-TQD 型超高效液相串联三重四极杆质谱联用
17、仪(TQD,美国 Waters 公司);低温高速离心机(Allegra 64R,美国 Beckman Coulter 公司);氮吹浓缩装置(MTN-2800D,天津奥特赛恩斯仪器有限公司);电子天平(EL204,上海梅特勒-托利多有限公司);匀浆机(T10 basic,德国 IKA 公司)。1.3 实验方法1.3.1 供试品的制备 临床上 SGI 的单次每日剂量为 100 200 mL。9中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.9因此,按物种间转换计算后大鼠所需剂量为 10.521.0 mL
18、/kg。然而,实验所需的注射量将超过大鼠的正常注射量(10 mL/kg)。因此按照参芎葡萄糖注射液国家药品标准(WS-10001-(HD-1136)-2002)“处方”和“制法”项下进行供注射用实验样品的制备,川芎嗪组(LG,不含丹参提取物)、丹参组(DS,不含川芎嗪)和川芎嗪-丹参组(LD)同比例加入葡萄糖、甘油和注射用水量,调至 pH=5.56.5,并进行过滤、灭菌。采用 HPLC 测得 LD 组中各成分的质量浓度为川芎嗪1.368 mg/mL、丹参素0.378 mg/mL。1.3.2 盐酸异丙肾上腺素溶液的配制 称取盐酸异丙肾上腺素 0.1 g 于 10 mL 容量瓶中,加入生理盐水溶解
19、并定容至刻度,配制成质量浓度为 10 mg/mL 的盐酸异丙肾上腺素溶液,现配现用。1.3.3 对照品溶液的配制 精密称取丹参素、盐酸川芎嗪、木犀草苷(TQD内标)、葛根素(TQS 内标)对照品适量至 10 mL 容量瓶,加甲醇适量,超声溶解并定容至刻度,得丹参素、川芎嗪、木犀草苷、葛根素的浓度分别为 1.030 mg/mL、0.9986 mg/mL、1.052 mg/mL、1.023 mg/mL的储备液。分别精密吸取丹参素、川芎嗪对照品储备液适量,加 50%甲醇稀释得 8.240 g/mL、29.958 g/mL 的混合对照品母液,再用 50%甲醇 2 倍逐级稀释得到不同浓度梯度的混合对照品
20、工作液。1.3.4 色谱与质谱条件 采用实验室前期建立的色谱和质谱条件9,保护柱:Waters Van Guard BEH C18(2.15 mm,1.7 m),色谱柱:Waters BEH C18(2.1 150 mm,1.7 m),柱温:40,流速:0.35 mL/min,流动相:0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱:01.0 min,92%A;1.01.5 min,92%70%A;1.52.0 min,70%60%A;2.02.5 min,60%10%A;2.53.0 min,10%A;3.0 4.0 min,10%92%A,进样体积:1 L。由于 SGI 中川芎嗪与丹参素在仪器中
21、响应差别较大,故本实验中川芎嗪采用 TQD 检测(内标为木犀草苷),丹参素采用 TQS 检测(内标为葛根素)。采用电喷雾电离源(ESI),电毛细管电压 3 kV,离子源温度 120,喷雾气与反吹气 N2,去溶剂气温度350,去溶剂气流速 650 L/hr,扫描方式为多反应监测(MRM),Masslynx 4.1 工作站进行数据采集及处理。TQS 中用于定量分析的离子对分别为丹参素为 m/z 197.5162.7、葛根素(内标)m/z 415.1267.0,锥孔电压分别为 25、35 V,碰撞电压分别为20、25 V,均为负离子扫描模式;TQD 中用于定量分析的离子对分别为川芎嗪为 m/z 13
22、7.155.1、木犀草苷(内标)m/z 449.1250.9,锥孔电压分别为40、30 V,碰撞电压分别为 20、25 V,均为正离子扫描模式。1.3.5 动物分组、给药与组织样品收集 取 96 只健康 SD 大鼠,实验前禁食 12 h,自由饮水。按 50 mg/kg 剂量皮下注射盐酸异丙肾上腺素,每天给药 1 次,连续给药 2 d 制备 AMI 模型大鼠9。造模后,随机分为川芎嗪组(ligustrazine,LG)、丹参组(Danshen,DS)和川芎嗪-丹 参 组(ligustrazine-Danshen,LD)(每组 30 只)、空白组 6只。除空白组大鼠给予等量生理盐水,其余组大鼠按
23、10 mL/kg(相当于川芎嗪 13.68 mg/kg,丹参素3.78 mg/kg)剂量进行尾静脉注射。于给药后 1、5、10、30、60 min 处死大鼠,空白组于注射 60 min 后处死,在冰床上迅速剥离心脏、肝、脾、肺、肾、脑组织,各组织按 w v=1 2 加入生理盐水在冰浴中匀浆,8000 r/min 离心 10 min,分离上清液于-20保存备用。1.3.6 组织样品前处理 对实验室前期采用的样品处理方法9进行优化后用于本部分实验。取上述组织匀浆上层液 200 L,依次加入 20 L 内标(葛根素 1 g/mL,木犀草苷 150 g/mL),60 L 盐酸(1 mol/L),1 m
24、L 乙酸乙酯,涡混 5 min,超声 10 min,于 4下 14 000 r/min离心 10 min,取上清液 a;沉淀中依次加入 40 L NaOH(1 mol/L),1 mL 乙酸乙酯,涡混 5 min,超声10 min,于 4下 14 000 r/min 离心 10 min,取上清液加入 100 L 盐酸甲醇溶液(1 mol/L),得 b 液,合并 a、b 液,30氮气吹干,剩余残渣用 200 L 50%甲醇溶解,于 4下 15 000 r/min 离心 10 min,取上清液进样分析。1.4 统计学方法 采用 WinNonLin 8.2(Phoenix,美国 Pharsight公司
25、)软件中的非房室模型计算川芎嗪和丹参素在组织中的 AUC0-t参数。用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析,实验结果以平均数标准差(xs)表示,采用独立样本 t 检验进行组间比较,以 P0.05计为差异具有统计学意义。01中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.92 结果2.1 方法学考察 通过对心脏、肝、脾、肺、肾、脑各组织间基质效应比较,质量控制样本(QC)在不同基质中没有明显的基质效应影响。因此随机抽取了心脏、肝两个组织进行了方法学考察。注:A:空白组织;B:空白组织加入混合对
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