白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其诱导凋亡作用的实验研究.pdf
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1、 866中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.2023Vol.30No.5白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其诱导凋亡作用的实验研究汪丽娜,任若瑜,何富乐?(1永康市中医院药剂科浙江永康32 130 0;浙江中医药大学第一临床医学院浙江杭州310 0 53)摘要目的:探究白皮杉醇对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及相关的作用机制。方法:采用CCK8法检测不同浓度的白皮杉醇对SKOV-3细胞增殖能力的影响;采用细胞划痕实验检测不同浓度的白皮杉醇对SKOV-3细胞迁移能力的影响;采用Transwell 侵袭实验检测不同浓度的白皮杉醇对SKOV-3细胞
2、侵袭能力的影响;采用DAPI染色法检测不同浓度白皮杉醇对SKOV-3细胞凋亡的影响;采用Westermblot实验检测SKOV-3细胞核增殖抗原(Ki67)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、BCL-2相关X蛋白(Bax)和活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase-3)的表达水平。结果:白皮杉醇能够明显抑制SKOV-3细胞的增殖能力,明显降低SKOV-3细胞的迁移能力和侵袭能力;明显提高SKOV-3细胞的凋亡水平;白皮杉醇干预后,SKOV-3细胞Ki67和Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax和 Cleaved caspase-3蛋白表达显著升高。结论:白皮杉醇能够有效抑制SKOV-3细
3、胞的增殖、迁移和侵袭,并能够诱导SKOV-3细胞凋亡。关键词卵巢癌SKOV-3细胞;白皮杉醇;增殖;迁移;侵袭;凋亡;体外实验Experimental Study on Effects of Piceatannol on Proliferation,Migration and Invasion ofOvarian Cancer Cells and Its Inducing Apoptosis EffectWANG Lina,REN Ruoyu,HE Fule?(Department of Pharmacy,Yongkang Hospital of Chinese Medicine,Yongka
4、ng,Zhejiang 321300;2 First Clinical Medical Cllege,Zhejiang Chinese Medicine University,Hangzhou,Zhejiang 310053)ABSTRACT Objective:To investigate the effects of Piceatannol on proliferation,migration,and invasion ofhuman ovarian cancer SKOV-3 cells and its inducing apoptosis and the related mechani
5、sms.Methods:CCK8assay was used to detect the effect of different concentrations of Picerlitol on the proliferation of SKOV-3 cells,cell scratch assay was used to detect the effect of different concentrations of Picerlitol on the migration ability ofSKOV-3 cells,transwell invasion assay was used to d
6、etect the effect of different concentrations of Piceatannol onthe invasion ability of SKOV-3 cells,DAPI staining was used to detect the effect of different concentrations ofPicerlitol on apoptosis of SKOV-3 cell.The expression levels of Ki67,Bcl-2,Bax and Cleaved caspase-3 inSKOV-3 cells were detect
7、ed by Westermn blot assay.Results:Piceatannol could significantly inhibit the proli-feration of SKOV-3 cells,inhibit the migration and invasion of SKOV-3 cells,increase the apoptosis of SKOV-3 cells.After Piceatannol intervention,the protein expressions of Ki67 and Bcl-2 in SKOV-3 cells weresignific
8、antly decreased,while the protein expressions of Bax and Cleaved caspase3 were significantly increased.Conclusion:Piceatannol could effectively inhibit the proliferation,migration and invasion of SKOV-3 cells,andinduce the apoptosis of SKOV-3 cells.Key words human ovarian cancer SKOV-3 cells;Piceata
9、nnol;proliferation;migration;invasion;apoptosis;in vitro白皮杉醇是一种多酚类化合物,其结构与白藜芦醇相似,广泛存在于甘蔗、葡萄、大戟、桂皮以及基金项目:浙江省基础公益研究计划项目(LGF20H270010)通讯作者:何富乐,E-mail:白茶树等植物11。白皮杉醇具有多种药理活性,例如抗氧化、抗炎、抑菌、抗衰老、抗白血病、调节免疫功能等 2-4;此外,越来越多的研究表明,白皮杉醇对乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病等多种肿瘤细胞均有明显的抑制作用 5-7 ,表明其具有一定中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.202
10、3Vol30No.5的抗肿瘤能力。目前关于白皮杉醇在卵巢癌中的作用及相关的机制仍未见报道,本研究以卵巢癌细胞株 SKOV-3为研究对象,旨在探讨白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其诱导凋亡作用和相关机制,为白皮杉醇的临床应用提供实验室依据。1实验材料1.1实验细胞包人卵巢癌细胞SKOV-3:上海赛百公司。1.2药物与试剂白皮杉醇:成都德思特生物技术有限公司,批号:DST190812-023。DMEM高糖培养基:美国Hyclone公司;胎牛血清:浙江天杭生物科技公司;CCK8试剂盒:美国MCE公司,批号:#2 136 8;结晶紫:上海强顺化学试剂公司;DAPI染料:上海碧云天公司;BC
11、A蛋白测定试剂盒:北京索莱宝科技有限公司;Ki67Antibod-y、Be l -2 A n t i b o d y、Ba x A n t i b o d y,Cl e a v e d Ca s p a s e -3Antibody,G A PD H A n t i b o d y:美国Affinity公司,批号:34e1264,65k2435、43k 2 132、48 k 359 1。1.3仪器CMaxPlus 型酶标仪:美国Molecular De-vices公司;Micro17R型低温高速离心机:美国Ther-mo公司;BB150型细胞培养箱:美国Thermo公司;AE2000型光学显微
12、镜:中国Motic公司;Ts2-FC型倒置荧光显微镜:日本尼康公司;EPS300型电泳仪:上海天能生命科学有限公司;6 10 0 2 0-9 Q型化学发光仪:上海勤翔科学仪器有限公司。2实验方法2.1细胞培养人卵巢癌SKOV-3细胞解冻复苏后,制成细胞悬液,接种于培养基中(10%胎牛血清、10 0 U/mL青霉素、10 0 g/L链霉素),常规培养于37,5%CO,细胞培养箱,1 2 d换液1次,显微镜下观察,待细胞长至对数生长期时用0.2 5%胰蛋白酶(含0.0 2%EDTA)消化后传代。2.2CCK8检测细胞活性取对数生长期细胞接种于9 6 孔板内,随机分为空白对照组(0 mol/L)、白
13、皮杉醇低剂量组(2 0 mol/L)、白皮杉醇中剂量组(40 mol/L)和白皮杉醇高剂量组(8 0 mol/L)。待细胞贴壁后,分别加人相应浓度的药物,继续培养2 4h和48 h后,每孔加人10 LCCK-8溶液,在培养箱内孵育。用酶标仪测定450 nm处的吸光度,计算细胞活性。相对细胞活性=(实验组OD值/空白组 OD 值)10 0%。2.3细胞划痕实验检测细胞迁移能力按照“2.2中方法分组,用记号笔在6 孔板背后均匀划867横线且横穿过孔,每孔至少穿过3条线。取对数期的SKOV-3细胞进行铺板,细胞密度为每孔510个,过夜后细胞覆盖整板。第2 天用1mL枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线
14、划痕,划痕后用PBS洗细胞3次,除去划下的细胞,再加人无血清培养基,根据分组情况加入相应浓度的药物,继续培养2 4h后观察划痕实验结果并取样拍照。利用ImageJ软件测量每孔多个点划痕间距,取均值,0 h和2 4h时划痕的宽度分别记为A和B,迁移率=(A-B)/A。2.4Transwell检测细胞侵裂能力按照“2.2 中方法分组,用无血清DMEM高糖培养液稀释Matri-gel,稀释比例为3:1,取30 L稀释后的Matrigel包被Transwell小室,置于4孵育过夜;取对数期SK-OV3细胞按上述分组情况用相应浓度的药物处理24h后,将Transwell小室放入2 4孔培养板,上室加人S
15、KOV3细胞,置培养箱中继续培养2 4h,棉签擦掉基质胶和上室底层细胞,4%多聚甲醛固定10min,PBS洗3次,0.1%结晶紫染液染色30 min后拍照并计数侵袭至下室中的细胞数量。2.5DAPI染色法检测细胞凋亡按照“2.2”中方法分组,取对数期的SKOV-3细胞传代于2 4孔板中,再以6 0%7 0%细胞密度种板,细胞贴壁后按分组给予相应浓度的白皮杉醇,药物作用结束弃去培养液后用多聚甲醛固定细胞10 min,PBS清洗2次,然后DAPI核染(1 mg/LDAPI作用2 min);再次PBS液洗2 次后无菌水洗1次。在载玻片上滴甘油,载玻片上小心黏附盖玻片,在荧光显微镜下观察细胞并拍照。凋
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