白藜芦醇对5_6肾切除大鼠肌肉萎缩的保护作用及相关机制.pdf
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1、*基金项目国家自然科学基金资助面上项目(82170750)袁江苏省自然科学基金资助面上项目(BK20201210)*作者简介王蕤婷袁女袁汉族袁生于 1994 年 7 月袁甘肃省陇南市人袁硕士袁研究方向院慢性肾脏病及其并发症遥*通信作者黄新忠袁电话院0513-81168401袁E-mail:南 通 大 学 学 报 渊 医 学 版 冤Journal of Nantong University(Medical Sciences)2023 颐 43渊4冤DOI:10.16424/32-1807/r.2023.04.001引文格式院 王蕤婷,李璐,宫海凤,等.白藜芦醇对 5/6 肾切除大鼠肌肉萎缩的保护
2、作用及相关机制J.南通大学学报(医学版),2023,43(4)颐301-305.白藜芦醇对 5/6 肾切除大鼠肌肉萎缩的保护作用及相关机制*王蕤婷*袁李璐袁宫海凤袁张玲玲袁黄新忠*(南通大学附属医院肾内科袁南通 226001)摘要目的院探讨白藜芦醇(resveratrol,RSV)对 5/6 肾切除大鼠肌肉萎缩的保护作用及对肌营养不良蛋白(dys鄄trophin)尧肌肉环状脂蛋白-1(musclering finger-1,MuRF-1)尧肌肉萎缩蛋白-1(MAF-bx,又名 Atrogin-1)及肌肉生长抑制素(Myostatin)的影响遥 方法院采用两步法建立雄性 Sprague-Dawl
3、ey 大鼠 5/6 肾切除模型遥 术后 1 周开始予 20 mg/(kg 窑 d)RSV 灌胃袁至术后 12 周处死大鼠袁随机分为 3 组院对照组(Sham 组,n=10)尧5/6 肾切除组(Nx 组,n=10)尧5/6 肾切除+RSV 干预组(Nx+RSV 组,n=10)袁收集血液检测血清肌酐(serum creatinine,SCr)尧血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)含量袁取肾脏组织行过碘酸-雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色尧Masson 染色观察肾脏病理变化袁取胫骨前肌用于 HE 染色观察肌纤维的形态和大小袁免疫组织化学法观察肌肉中
4、dystrophin 表达及分布情况遥 Western Blot 分析检测大鼠肌肉组织中肌萎缩相关蛋白 MuRF-1尧Atrogin-1尧Myostatin 的表达遥 结果院(1)与 Sham 组相比袁Nx 组大鼠在术后 12 周开始出现 SCr尧BUN水平升高袁RSV 干预可改善肾功能遥(2)Nx 组大鼠肾小球硬化指数(glomerular sclerosis index,GSI)及肾小管间质纤维化指数(tubulointerstitial fibrosis index,TFI)升高袁RSV 干预后得到改善遥(3)Nx 组大鼠胫骨前肌出现肌纤维横截面积缩小袁dystrophin 表达减少袁A
5、trogin-1尧MuRF-1尧Myostatin 表达增加袁RSV 干预后改善了肌纤维萎缩袁上调了 dystrophin 表达袁降低 Atrogin-1尧MuRF-1尧Myostatin 表达遥 结论院RSV 可改善 5/6 肾切除大鼠的肾功能及肌肉萎缩袁其机制可能与上调 dys鄄trophin 表达袁降低 Atrogin-1尧MuRF-1尧Myostatin 表达有关袁提示 RSV 可能是 5/6 肾切除肌肉萎缩的一个潜在治疗药物遥关键词5/6 肾切除曰肌肉萎缩曰白藜芦醇曰肌肉环状脂蛋白-1曰肌肉萎缩蛋白-1曰肌生长抑制素曰大鼠中图分类号R692文献标志码A文章编号1674-7887渊20
6、23冤04-0301-05Protective effects of resveratrol on muscle atrophy in 5/6 nephrectomy rats and its mechanisms*WANG Ruiting*,LI Lu,GONG Haifeng,ZHANG Lingling,HUANG Xinzhong*(Department of Nephrology,the Affili鄄ated Hospital of Nantong University,Nantong 226001)AbstractObjective:To investigate the prot
7、ective effects of resveratrol(RSV)on muscle atrophy and the effects of dystrophin,musclering finger-1(MuRF-1),MAF-bx(also named Atrogin-1)and Myostatin in 5/6 nephrectomy rats.Methods:The 5/6nephrectomy model of male Sprague-Dawley rats was established by two-step method.Rats were intragastrically a
8、dministeredwith RSV 20 mg/(kg窑 d)1 week after surgery and sacrificed 12 weeks after surgery.Next,they were randomly divided intothree groups:Control group(Sham group,n=10),5/6 nephrectomy group(Nx group,n=10),5/6 nephrectomy+RSV interventiongroup(Nx+RSV group,n=10).The bloods were collected for dete
9、rmination of serum creatinine(SCr)and blood urea nitrogen(BUN)in renal function.Moreover,the renal tissues were stained with periodic acid-schiff(PAS)stain and Masson for observationof renal pathological changes,and tibialis anterior was used for HE staining to observe the morphology and size of mus
10、clefibers.The expression and distribution of dystrophin were observed by immunohistochemistry.The expression levels of MuRF-1,Atrogin-1 and Myostatin proteins in rat muscle were detected by Western Blot.Results:(1)Compared with the Sham group,rats in the Nx group SCr and BUN levels started to increa
11、se at 12 weeks after surgery,and RSV intervention could improverenal function.(2)The glomerular sclerosis index(GSI)and tubulointerstitial fibrosis index(TFI)of rats in the Nx group wereincreased,and they were improved after RSV intervention.(3)In the tibialis anterior of rats in the Nx group,the cr
12、oss-sectional area of muscle fibers was decreased,the expression of dystrophin was decreased,and the expressions of Atrogin-1,MuRF-1 and Myostatin were increased.RSV intervention improved the atrophy of muscle fibers,up-regulated the expressionof dystrophin,and reduced the expressions of Atrogin-1,M
13、uRF-1 and Myostatin.Conclusion:RSV can improve renal functionand muscle atrophy in rats with 5/6 nephrectomy,and its mechanism may be related to the up-regulation of dystrophin301窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊4冤expression and the down-regulation of Atrogin-1,MuRF-1 and Myostatin expression,suggestin
14、g that RSV may be a potentialtherapeutic drug for muscle atrophy after 5/6 nephrectomy.Key words5/6 nephrectomy;muscle atrophy;resveratrol;musclering finger-1;Atrogin-1;Myostatin;rat慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)现已成为一个全球性公共卫生问题,在接受血液透析的终末期肾病患者中有 20%55%出现肌肉萎缩1。肌肉萎缩是指骨骼肌体积和同龄人或自身肌肉以前的状态相比出现下降,导致肉眼或
15、影像学检查可见肌肉缩小的一种疾病2。CKD 患者随着病情进展,会出现肌肉萎缩及相关并发症,如肌肉疼痛、无力、疲劳及运动耐力下降等,同时骨折和跌倒的风险也显著升高,大大降低了患者的生活质量及生存率。肌肉萎缩是一个涉及信号通路和萎缩相关基因转录控制的过程,正常人体内肌节功能的维持主要有3 个蛋白水解系统,分别为胞质钙蛋白酶系统、泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)及自噬-溶酶体系统。肌原纤维蛋白降解需要三类酶的协调作用,其中最主要的就是 E3 泛素连接酶3。肌肉环状脂蛋白-1(musclering finger-1,MuRF-1)由 353 个氨基酸
16、残基组成,包含 1 个典型的 N 末端环结构域,该结构域是肌肉特异性 E3 泛素连接酶之一,在 CKD的萎缩肌肉中高度表达,可通过 UPS 增加肌肉蛋白水解,促进肌肉萎缩的发生4。肌肉萎缩蛋白-1(MAF-bx,又名 Atrogin-1)也是在骨骼肌中高度表达的 E3泛素连接酶之一,指导蛋白质的多泛素化,通过 26S蛋白酶体将肌肉蛋白进行水解,发生肌肉萎缩5。肌肉生长抑制素(Myostatin)也称为生长和分化因子-8(growthand differentiation factor-8,GDF-8),是分泌型生长因子 TGF-茁 超家族的成员,是现知的肌肉质量负性调节因子,在 TGF-茁 超
17、家族中具有独特性,几乎只表达于骨骼肌谱系6。肌营养不良蛋白(dystrophin)是肌肉细胞中一种关键的细胞骨架结构蛋白,位于肌纤维中肌膜的内层,可连接细胞内区域与细胞外基质蛋白,增加肌膜连接处稳定性7,保护肌纤维在收缩期间保持稳定8。Dystrophin 表达的减少或合成的提前会使肌膜连接处稳定性下降,诱导肌肉萎缩的发生,如单基因遗传疾病杜氏营养不良9。同时,功能性 dystrophin的缺失也会诱导肌纤维膜脆弱,导致进行性肌肉变性,诱导肌萎缩10。研究11表明,dystrophin 在稳定肌膜及对抗肌肉收缩与拉伸中具有关键作用。白藜芦醇(resveratrol,RSV)又名芪三酚,也称为3
18、,4忆,5-三羟基二苯乙烯,是一种天然的非黄酮类化合物12。已证实,RSV 可预防和减缓多种疾病的进展,如通过调节转录因子和控制小 RNA 的表达表现出抗肿瘤的作用。同时,也是潜在的抗衰老剂,可延缓各种生物体的寿命。RSV 其他作用还包括:保护心脏、调节雌激素受体、预防皮肤癌、抗炎性细胞因子、调节免疫等13。但其是否能缓解 CKD 肌肉萎缩目前尚未见报道。本研究旨在揭示 RSV 对 5/6 肾切除大鼠肾功能、肾脏组织结构及肌肉纤维的保护作用及相关机制。1材料与方法1.1主要试剂血清肌酐(serum creatinine,SCr)检测试剂盒、血尿素氮(blood urea nitrogen,BU
19、N)检测试剂盒(重庆 Biostec);Masson 三色染色试剂盒、过碘酸-雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色液、HE 染色液(北京 Solarbio);dystrophin 单克隆抗体、Atrogin-1单克隆抗体、MuRF-1 单克隆抗体、Myostatin 单克隆抗体(美国 Santa Cruz);兔抗大鼠 GAPDH 单克隆抗体(英国 Abcam)。1.2实验方法1.2.1动物模型构建于南通大学实验动物中心采购雄性 68 周的健康 Sprague-Dawley 大鼠(200220 g)30 只,随机分成对照组(Sham 组,n=10)、5/6 肾切除组(Nx
20、 组,n=10)、5/6 肾切除+RSV 干预组(Nx+RSV组,n=10)。动物实验获南通大学动物实验伦理委员会批准(伦理审批号:SYXK(苏)2022-0046)。按照两步法进行 CKD 模型构建:10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔内注射进行麻醉,在大鼠右肋下脊直肌外侧剪开皮肤及肌肉,暴露肾脏,分别在肾脏上、下两极切除右肾的 2/3,随后逐层缝合,然后常规饲养。1 周后剪开左侧背部皮肤暴露左侧肾脏,结扎肾蒂,切除整个左侧肾脏。Sham 组采用相同的步骤进行手术,未切除肾脏。术后 1 周开始予 20 mg/(kg d)RSV 灌胃。术后 12 周处死大鼠,收集血液检测肾功能,取肾脏组织
21、切片行病理分析,取胫骨前肌行 HE 染色、免疫组织化学及 Western Blot 分析。1.2.2生化指标测定大鼠肾功能中 SCr、BUN 的测定用 ELISA 定量试剂盒,经全自动生化分析仪测定(Modular)。1.2.3PAS 染色和 Masson 染色大鼠肾脏组织取出后立即固定于 4%多聚甲醛中,进行石蜡包埋,切302窑窑成 3 mm 薄片进行 PAS 染色和 Masson 染色,然后光镜观察肾脏结构变化。采用半定量分析法计算肾脏肾小球硬化指数(glomerular sclerosis index,GSI)及肾小管间质纤维化指数(tubulointerstitial fibrosis
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