不同品系小鼠对炭疽芽胞杆菌弱毒株芽胞的敏感性研究.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目()国家自然科学基金项目()作者简介:袁璐 女硕士研究生 研究方向为病原细菌学:.陈楠 女硕士 研究方向为病原细菌学:.袁璐与陈楠为并列第一作者 通讯作者 刘先凯男副研究员博士硕士生导师 研究方向为病原微生物致病机理及防控:.王恒樑男研究员博士博士生导师 研究方向为病原微生物致病机制与基因工程疫苗:.收稿日期:不同品系小鼠对炭疽芽胞杆菌弱毒株芽胞的敏感性研究袁 璐 陈 楠 王东澍 吕宇飞 郭 艳 陈 杰 刘先凯 王恒樑(.上海海洋大学 食品学院上海.军事科学院军事医学研究院生物工程研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室北京)摘 要 通过比较四种品系小鼠对炭疽芽胞
2、杆菌()(简称炭疽杆菌)弱毒株芽胞的敏感性确定炭疽杆菌弱毒株芽胞攻毒合适的动物模型 采用炭疽杆菌弱毒株(、)和(、)的芽胞对四种品系小鼠(/、和/)进行腹腔攻毒记录小鼠死亡时间计算、绘制存活曲线并统计分析 运用较敏感的 小鼠研究不同 基因型毒素缺陷株(含 拷贝数不同)芽胞的毒力差异 利用更为敏感的/小鼠评价 层蛋白 对荚膜缺陷株芽胞毒力的影响 结果表明在四种品系小鼠中毒素缺陷株芽胞的毒力均高于荚膜缺陷株芽胞的毒力/小鼠对炭疽杆菌弱毒株芽胞的剂量依赖关系最好最为敏感其次是 小鼠而 小鼠和/小鼠对炭疽杆菌弱毒株芽胞不敏感 确定了/小鼠和 小鼠在炭疽杆菌弱毒株芽胞研究中的适用性 使用 小鼠评价了不同
3、 基因型炭疽杆菌芽胞的毒力差异结果表明不同 基因型炭疽杆菌由于所含 质粒拷贝数的差异导致芽胞的毒力不同 使用/小鼠评价了 层蛋白 缺失对炭疽杆菌芽胞毒力的影响表明 基因的缺失导致炭疽杆菌芽胞毒力降低关键词 炭疽芽胞杆菌弱毒株小鼠品系 基因型层蛋白中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.).()()(/).(微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .)./././././.炭疽芽胞杆菌()(简称炭疽杆菌)是一种古老的革兰阳性菌可引起人兽共患病炭疽 炭疽杆菌含有两个毒力大质粒和 分别编码炭疽毒素和荚膜在营养匮乏时炭疽杆菌能形成含水量极低的芽胞体具有极强抵抗不利条件的抗逆性能在土壤中存活数十年
4、 感染过程中炭疽杆菌由芽胞萌发成为具有代谢活力的繁殖体细胞并伴随着炭疽毒素的分泌和荚膜的形成 炭疽毒素和荚膜对于炭疽杆菌毒力发挥都是必不可少的由于炭疽杆菌致病性高强毒株的实验一般需要在 实验室中进行 因此弱毒株被广泛应用于炭疽杆菌的研究以降低实验室生物安全风险 在炭疽疫苗的研发过程中也广泛使用炭疽杆菌弱毒株一般采用高温、紫外线、吖啶橙等理化手段对 或 质粒进行驱除常见的减毒株有 ()、()、()和()等 王恒樑课题组在前期研究中利用质粒不相容原理成功构建了三株弱毒株分别为毒素缺陷株()、荚膜缺陷株()和双质粒缺失株 ()可以有效避免传统的理化方法在减毒过程中对细菌染色体的影响 可用于炭疽杆菌研
5、究的动物模型有很多种例如猴、家兔、豚鼠和小鼠等 目前研究显示灵长类动物对炭疽毒素敏感性较好但受到培养条件要求高、市场价格昂贵等情况的限制不能广泛应用于常规实验室此外兔类对炭疽毒素中度敏感但体型较大不易操作 相比之下小鼠具有个体小、易于喂养和处理、方便操作、价格便宜等优点所以小鼠模型成为一种常见的选择 大多数品系小鼠对炭疽杆菌强毒株的芽胞攻毒很敏感但对炭疽杆菌弱毒株芽胞攻毒却表现出了不同的敏感性 据报道/小鼠和/小鼠对 菌株敏感这主要是因为缺乏对小鼠免疫应答至关重要的血清补体/小鼠对()菌株敏感但对 菌株不敏感 也有研究认为 小鼠对炭疽杆菌是敏感的并用于评价炭疽杆菌芽胞免疫保护性研究 小鼠源于
6、研究所的 小鼠也被广泛应用于炭疽杆菌的研究 小鼠是我国产量最高的小鼠同样起源于 小鼠 在我国 小鼠已广泛应用于药理学、毒理学和微生物学研究 然而有关 小鼠在炭疽杆菌弱毒株毒力评价中应用的研究尚未见报道 虽然不同品系小鼠对炭疽杆菌野生株敏感性的研究比较多但是还未见不同品系小鼠对炭疽杆菌弱毒株敏感性的文献报道 本研究采用炭疽杆菌弱毒株芽胞对国内常用的四种品系小鼠进行腹腔注射攻毒比较四种品系小鼠对炭疽杆菌弱毒株芽胞的敏感性 确定了/小鼠在炭疽杆菌弱毒株芽胞研究中的适用性并使用/小鼠检测了 层蛋白 缺失对炭疽杆菌芽胞毒力的影响 还使用 小鼠检测了不同 基因型炭疽杆菌芽胞的毒力差异 旨在评价国内比较容易
7、获得的不同品系小鼠对炭疽杆菌弱毒株芽胞的敏感性选取较合适的攻毒模型为今后的炭疽杆菌弱毒株芽胞毒力评价、致 期 袁璐等:不同品系小鼠对炭疽芽胞杆菌弱毒株芽胞的敏感性研究 病机制研究、疫苗保护性分析等实验提供参考 材料与方法.材料.小鼠 本研究符合中华人民共和国科学技术部制定的实验动物护理和使用指南 所有动物实验均经动物护理和使用委员会批准(批准号:)级/、和/小鼠雌性均购自北京维通利华实验动物技术有限公司 实验使用小鼠均为 周龄每只体重约为 .菌株毒素缺陷株 (不产炭疽毒素但有荚膜)、荚膜缺陷株(产炭疽毒素但无荚膜)、双质粒缺失株(不产炭 疽 毒 素 且 无 荚 膜)均 从 ()中 获 得 毒
8、素 缺 陷 株、和 均来自不同 基因型中分离株的 质粒缺失株(表)表 本研究使用的菌株 菌株特征来源使用质粒不相容原理从野生株 中驱除 质粒的突变株 本实验室使用质粒不相容原理从野生株 中驱除 质粒的突变株 本实验室使用质粒不相容原理从野生株 中驱除 和 质粒的突变株 本实验室我国人用炭疽杆菌疫苗株 本实验室使用/系统从菌株.中驱除 质粒的突变株 本实验室使用/系统从菌株.中驱除 质粒的突变株 本实验室使用/系统从菌株.中驱除 质粒的突变株 本实验室使用/系统从菌株./中驱除 质粒的突变株 本实验室使用 基因替代的方法在菌株 中敲除 基因本实验室使用 基因替代的方法在菌株 中敲除 基因本实验室
9、使用 基因替代的方法在菌株 中敲除 基因本实验室 注:“本实验室”为军事科学院军事医学研究院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室.培养基 液体培养基:蛋白胨/酵母提取物 /灭菌 琼脂培养基:蛋白胨 /酵母提取物 /琼脂粉 /灭菌 琼脂培养基(芽胞形成培养基):营养肉汤()/./琼脂粉 /灭菌 使用时添加经过滤除菌的 /./.主要试剂与仪器设备基因组提取试剂盒(北京天根有限公司)泛影酸钠、泛影葡胺(武汉赛沃尔化工有限公司)(中国 公司)(美国 公司)引物合成(北京天一辉远有限公司)生物安全柜(新加坡 公司)隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)高速冷冻离心机(美国 公司)仪(美国
10、 公司).方法.突变株构建使用 技术对.、.、.和./菌株进行 质粒的快速驱除采用同源重组技术在 中获得基因缺失株、和(表).芽胞的培养收集挑取菌落接于 液体培养基、/培养至 时期(对数期与稳定期拐点设置为 之后第 个小时为)在罗氏瓶中配制 琼脂培养基转接 菌液铺匀 正置培养过夜再转至 倒置培养 养成芽胞 无菌条件下在罗氏瓶中加入预冷的 无菌 甘油溶液用无菌玻璃棒刮取培养基上的芽胞 微 生 物 学 杂 志 卷水浴 使繁殖体断链 过滤断链后的悬浊液 水浴 杀死繁殖体 冷却后、/离心 弃上清加入 芽胞洗液(其中含泛影酸钠 泛影葡胺.)洗涤后离心去除繁殖体再用预冷的 甘油洗涤 次 洗净的芽胞呈米白色
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