β-谷甾醇对小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成的影响.pdf
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1、SILIAO GONGYE2023年第44卷第20期 总第689期摘 要:为探讨-谷甾醇对泌乳动物乳腺乳蛋白和乳脂肪合成的影响,研究首先利用MTT法筛选出对小鼠乳腺上皮细胞生长增殖不受抑制的-谷甾醇剂量;采用qRT-PCR技术检测-谷甾醇处理乳腺上皮细胞后乳蛋白合成相关基因和乳脂肪合成相关基因的mRNA表达水平。结果表明:较高剂量(40120 mol/L)的-谷甾醇明显抑制小鼠乳腺上皮细胞的活力(P0.05),故后续试验添加5、10、20 mol/L的-谷甾醇处理乳腺上皮细胞。-谷甾醇明显提高酪蛋白基因CSN1S1、CSN2、CSN3及乳蛋白合成通路相关基因 JAK2、STAT5、mTOR、S
2、6K1 的 mRNA 表达水平(P0.05)。-谷甾醇显著上调乳脂肪合成关键调控因子SREBF1、PPARG、PPARGC1A和脂肪酸合成相关基因ACC、FAS、SCD的mRNA表达(P0.05)。由此可见,-谷甾醇能通过调节小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因的表达,进而促进乳腺细胞乳蛋白和乳脂肪的合成。关键词:-谷甾醇;乳腺上皮细胞;乳蛋白;乳脂肪;基因表达doi:10.13302/ki.fi.2023.20.012中图分类号:S816.7 文献标识码:A 文章编号:1001-991X(2023)20-0075-05Effect of-sitosterol on Milk Prote
3、in Synthesis and Milk Fat Synthesis in Mouse MammaryEpithelial CellsLIU Lili CHEN Min(College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Heilongjiang Harbin 150040,China)Abstract:To explore the effect of-sitosterol on the synthesis of milk protein and milk fat in the mammary gland of la
4、ctating animals.Firstly,MTT method was used to screen the -sitosterol dose that were not inhibited the growth and proliferation of mouse mammary epithelial cells.The mRNA expression levels of the genes related to milk protein synthesis and the genes related to milk fat synthesis in mammary epithelia
5、l cells after -sitosterol treatment were detected by qRT-PCR.The results showed that the higher dose(40-120 mol/L)-sitosterol significantly inhibited the cell viability of mouse mammary epithelial cells(P0.05).Thus,the mammary epithelial cells were treated with 5,10,20 mol/L-sitosterol in subsequent
6、 experiments.-sitosterol significantly increased the mRNA expression level of casein genes CSN1S1,CSN2,CSN3 and the genes related to milk protein synthesis pathway JAK2,STAT5,mTOR,S6K1(P0.05).-sitosterol significantly up-regulated the mRNA expression of the key regulatory factors of milk fat synthes
7、is SREBF1,PPARG,PPARGC1A and the genes related to fatty acid synthesis ACC,FAS and SCD(P0.05).Thus,-sitosterol can promote the synthesis of milk protein and milk fat by regulating the expression of genes related to milk protein synthesis and milk fat synthesis in mouse mammary epithelial cells.Key w
8、ords:-sitosterol;mammary epithelial cells;milk protein;milk fat;gene expression-谷甾醇对小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成的影响 刘莉莉 陈 敏(黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040)作者简介:刘莉莉,博士,教授,研究方向为中药对泌乳的调控。收稿日期:2023-05-18基金项目:国家自然科学基金项目8200393075试验研究2023年第44卷第20期 总第689期哺乳动物乳汁是最适合新生动物健康生长发育的天然营养物,乳汁含有丰富的蛋白质和脂肪,这些乳营养成分的合成与乳腺上皮细胞一些重要功能基因及信
9、号转导通路的调控密切相关。乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成,其中酪蛋白约占乳蛋白的80%,故其含量的高低常作为评价乳汁营养价值的重要指标。雷帕霉素靶点(mTOR)信号途径以及酪氨酸激酶 2/信号转导和转录激活因子 5(JAK2/STAT5)信号途径主要调控乳蛋白的合成,而且mTOR信号通路与JAK2/STAT5信号通路可相互影响协同调控乳蛋白的合成1。乳脂的主要成分是三酰甘油,主要由脂肪酸和磷酸甘油在乳腺上皮细胞中合成。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)和固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)是乳脂肪合成与分泌过程中最重要的两个调控因子,在乳脂肪合成基因网络中处于枢纽位置,二者可通过
10、结合靶基因,影响乳腺对脂肪酸的摄取、转运、从头合成和酯化过程2。提高乳质量及泌乳量是目前哺乳动物亟待解决的重要问题,天然药用植物及其提取物具有低毒、无残留、不易产生耐药性等优点,用于增乳有其独特优势。研究发现低剂量葛根素能增强小鼠乳腺乳蛋白和乳脂肪合成相关蛋白表达,提升乳品质3。槲皮素可以改善乳质量,提高小鼠乳蛋白、乳糖和乳脂肪合成相关基因的表达4。-谷甾醇作为一种植物甾醇,是很多药用植物的重要组成成分。临床试验研究证实-谷甾醇具有降胆固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和抗癌等多种生物活性。此外,研究发现-谷甾醇还可通过雌激素受体途径调节下游靶基因的表达而发挥植物雌激素样活性的作用5-6。植物雌
11、激素是许多植物中的天然化学成分,结构类似于雌激素17-雌二醇,可以与动物雌激素受体结合,发挥雌激素样活性7。许多增乳药用植物的活性成分中含有植物雌激素,其可通过调节泌乳相关激素的活性,促进乳腺发育,进而影响动物泌乳性能。然而关于-谷甾醇对小鼠乳腺上皮细胞(HC11)乳蛋白、乳脂肪的合成是否有影响尚未见报道。本研究以HC11细胞为模型,采用MTT法检测不同浓度-谷甾醇对HC11细胞增殖能力的影响,qRT-PCR技术检测-谷甾醇作用的HC11细胞中乳蛋白和乳脂肪合成相关基因的表达情况,为探讨-谷甾醇对HC11细胞乳蛋白和乳脂肪合成的调节机理提供理论基础,为利用天然植物活性成分提高哺乳动物乳品质提供
12、参考。1 材料与方法 1.1 材料小鼠乳腺上皮细胞(HC11)购自北京北纳创联生物技术研究院。-谷甾醇购自成都瑞芬思生物科技有限公司;MTT法细胞活力检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;RPMI-1640 干粉、胎牛血清(FBS)购自Gibco 公司;Trizol 购自 Invitrogen 公司;Prime ScriptTM RT reagent Kit试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自TaKaRa公司。1.2 HC11细胞的培养37、5%CO2培养条件下,利用生长培养基(RPMI-1640+10%FBS)培养 HC11 细胞,每隔 24 h 更换新鲜培养基。1
13、.3-谷甾醇对HC11细胞活力影响的检测试验分为对照组(接种HC11细胞但不加药处理)和不同浓度(5、10、20、40、80、100、120 mol/L)-谷甾醇组。每组5个重复孔。于96孔板中接种对数生长期的HC11细胞(1104个/孔),培养过夜,更换新鲜培养基并添加-谷甾醇,作用24 h后,各孔加入10 L MTT(5 mg/mL)继续培养4 h,吸出培养液,各孔分别加入100 L DMSO,振荡10 min,酶标仪检测490 nm的各孔吸光度(OD)值并进行计算,试验重复3次。1.4-谷甾醇对HC11细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因表达影响的检测 取对数生长期的HC11细胞接种于6孔板中
14、,待培养板中细胞融合度达到70%80%时,更换新鲜培养基,对照组HC11细胞添加正常细胞培养基,各试验组HC11细胞在添加正常细胞培养基的基础上,同时分别添加不同浓度的-谷甾醇(5、10、20 mol/L),每组设置5个重复孔。-谷甾醇作用细胞48 h,收集细胞,Trizol法提取RNA,根据Prime ScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书进行反转录,利用qRT-PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)检 测 HC11 细 胞 CSN1S1、CSN2、CSN3、mTOR、STAT5、JAK2、S6K1、4EBP1、SREBF1、PPARG、PPARGC1A
15、、ACC、FAS、SCD 基因的mRNA表达水平。各基因的引物序列见表1,-actin为内参基因。采用2-Ct相对定量的方法计算各基因的mRNA表达丰度。1.5 数据处理试验数据均以“平均数标准差”表示;采用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析,P0.05),而-谷甾醇添加量达到40 mol/L后,细胞活力随-谷甾醇添加浓度的升高而显著下降(P0.05)。后续试验采用对 HC11 细胞活力无抑制效果的 5、10、20 mol/L-谷甾醇处理细胞,以探究其对HC11细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因表达的影响。表1 实时荧光定量 PCR引物序列基因 CSN1S1CSN2CSN3STAT
16、5JAK2mTOR4EBP1S6K1ACCFASSCDSREBF1PPARGPPARGC1A-actin引物序列(53)F:TGCAGCATCTGAGGAACAAGR:TTCCAGGGTGCACTGGTTGF:TCACTCCAGCATCCAGTCACAR:GGCCCAAGAGATGGCACCAF:TTCAAACTGCCGTGGTGAGAR:GGCTAGCAGTAGCAGGCAAAF:TTTGTGATTGCTCGGTGTGR:AAGGGATGGTGGGAACGF:CGAGCGAAGATCCAAGACR:GCAGGGTTTCCAGGTTTATF:TCATCGAGGTGGATGACGAGR:CGCT
17、GATCCGGACCACATAF:AAGCAGGAGAAGCCAAAGR:GAAGAACCACAGAACCCACF:CATGGCAGGAGTGTTTGAR:TCATATGGTCCAACTCCCF:GAGAGGGGTCAAGTCCTTCCR:ACATCCACTTCCACACACGAF:ATCAGAAATTCAGCCCGTTGR:AAGTTGCATCCACCCAAATCF:CTAGGCTTGCCTTTGTCCAGR:GGTAGGGAGGATCTGGAAGCF:CTTCTGGAGACATCGCAAACR:GGTAGACAACAGCCGCATCF:GGAAGACCACTCGCATTCCTTR:GTAA
18、TCAGCAACCATTGGGTCAF:CCATACACAACCGCAGTCGCR:GTGGGAGGAGTTAGGCCTGCF:ACCGTGAAAAGATGACCCAGR:AGCCTGGATGGCTACGTACA细胞活力(%)5102010001201008060402004080aaaabcd-谷甾醇浓度(mol/L)注:柱顶字母不含有相同小写字母表示差异显著(P0.05);下图同。图1-谷甾醇对HC11细胞活力的影响2.2-谷甾醇对HC11细胞酪蛋白及乳蛋白合成相关基因表达的影响不同浓度-谷甾醇对 HC11 细胞酪蛋白基因mRNA表达的影响如图2所示,与对照组相比,5、10、20 mol/
19、L 的-谷甾醇均能显著提高 HC11 细胞CSN1S1、CSN2、CSN3基因mRNA表达水平(P0.05),其中5 mol/L-谷甾醇组细胞CSN1S1、CSN2、CSN3基因mRNA表达水平相对更高。基因相对表达量CSN1S186420CSN2CSN3ddaaaababbcc0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/Lc酪蛋白基因图2-谷甾醇对HC11细胞酪蛋白基因mRNA表达的影响不同浓度-谷甾醇作用下HC11细胞中乳蛋白合 成 信 号 通 路(JAK2/STAT5 和 mTOR)相 关 基 因 mRNA表达水平的变化如图3所示,与对照组相比,5、10、20 mol/L的
20、-谷甾醇组HC11细胞STAT5、JAK2、mTOR 和 S6K1 基因 mRNA 表达水平均显著升高(P0.05),而20 mol/L的-谷甾醇能显著提高HC11细胞4EBP1基因的mRNA表达(P0.05)。基因相对表达量STAT586420JAK2mTORdaabababbcd0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/LS6K14EBP1cccabbb ba乳蛋白合成信号通路相关基因图3-谷甾醇对HC11细胞乳蛋白合成信号通路相关基因mRNA表达的影响2.3-谷甾醇对HC11细胞乳脂肪合成相关基因表达的影响77试验研究2023年第44卷第20期 总第689期不同浓度-谷甾
21、醇对HC11细胞脂肪酸合成相关基因mRNA水平影响的检测结果如图4所示,与对照组相比,5、10、20 mol/L 的-谷甾醇均能明显上调HC11细胞ACC基因和SCD基因的mRNA表达水平(P0.05);而20 mol/L的-谷甾醇能显著提高FAS基因mRNA的表达(P0.05)。基因相对表达量ACC6420FASSCDcdabbaaabcb0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/Lb脂肪酸合成相关基因图4-谷甾醇对HC11细胞脂肪酸合成相关基因mRNA表达的影响不同浓度-谷甾醇作用下HC11细胞中乳脂肪合成关键调控因子基因(SREBF1 和 PPARG)及其辅助因子PPAR
22、GC1A基因mRNA表达水平的变化如图5所示,与对照组 HC11细胞相比,5、10、20 mol/L 的-谷甾醇均能显著提高 HC11 细胞 SREBF1、PPARG和 PPARGC1A 基因 mRNA 表达水平(P0.05)。其中5 mol/L-谷甾醇组细胞PPARG基因和PPARGC1A基因mRNA表达水平相对最高,10 mol/L-谷甾醇组细胞SREBF1基因mRNA表达水平相对最高。基因相对表达量SREBF16420PPARGPPARGC1Accaabaacbbd0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/Lb乳脂肪合成信号通路相关基因图5-谷甾醇对HC11细胞乳脂肪合成
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